蘇 晨 李國洋 劉 冬 錢林學(xué)* 曹艷平

隨著居民生活水平提高，肥胖患者日益增多，而非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率也在逐年升高[1]。NAFLD是一種由于脂滴在肝細(xì)胞內(nèi)堆積進(jìn)而形成疾病，根據(jù)肝臟中是否出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，可以分為單純性脂肪變性(simple steatosis，SS)和脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[2-3]；其中SS若不及時(shí)診斷和治療，則會(huì)進(jìn)展為NASH，后者10年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達(dá)25%[4-7]。因此，早期診斷NAFLD尤為重要。

超聲檢查是初步篩選NAFLD的首選方法，其價(jià)格低廉，無放射損傷，但對(duì)輕度脂肪肝不敏感，且難以鑒別肝纖維化[8-9]。目前，超聲彈性成像已被初步證實(shí)在評(píng)估慢性肝炎及肝纖維化程度上具有重要價(jià)值[10]。現(xiàn)有的超聲彈性成像技術(shù)都是基于假設(shè)肝臟是純彈性體的理論而發(fā)展的方法[11-12]。然而，所有生物組織都具有粘彈性，所以利用現(xiàn)有的超聲彈性成像技術(shù)來早期診斷SS并不理想[13-14]。壓痕松弛實(shí)驗(yàn)是一種用于表征固體粘彈性的可靠方法，因此，本研究旨在應(yīng)用壓痕松弛實(shí)驗(yàn)得到相關(guān)粘彈性參數(shù)，探究其與非酒精性肝臟脂肪變性程度的相關(guān)性，從而為其將來用于早期診斷SS奠定基礎(chǔ)[15]。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，體重為(200±20)g，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)，由首都醫(yī)科大學(xué)北京友誼醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。40只SD大鼠在取得病理結(jié)果之前，根據(jù)造模方法，將其隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)；實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各死亡3只；根據(jù)最終病理結(jié)果將剩余的34只SD大鼠重新分為正常(S0)組(7只)、輕度肝臟脂肪變性(S1)組(7只)、中度肝臟脂肪變性(S2)組(10只)和重度肝臟脂肪變性(S3)組(10只)，共4組。

1.2 儀器與飼料

采用ElectroForce?3100型壓痕實(shí)驗(yàn)儀(美國Bose公司)。高脂飼料選用MD12033 60%高脂飼料(江蘇美迪森公司)。

1.3 非酒精性脂肪變性肝臟模型建立

清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，在取得病理結(jié)果之前，將其隨機(jī)分為2組，即對(duì)照組(10只)和實(shí)驗(yàn)組(30只)，一周適應(yīng)性喂養(yǎng)之后，對(duì)照組10只大鼠繼續(xù)進(jìn)行基礎(chǔ)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組30只大鼠更換高脂飼料(60%高脂飼料，MD12033，平均每只20 g/d)喂養(yǎng)，之后每隔2周依次處理實(shí)驗(yàn)組10只及對(duì)照組3～4只。

1.4 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

將所有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的SD大鼠仰臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進(jìn)行腹腔麻醉，在劍突水平做腹橫切口(1.5～2.0 cm)，充分暴露肝臟后，將肝動(dòng)脈和肝門靜脈與下腔靜脈均進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎過程結(jié)束后，將肝臟分離。

1.5 實(shí)驗(yàn)原理與方法

粘彈性普遍存在于生物組織中，在外界應(yīng)力作用下會(huì)出現(xiàn)形變滯后現(xiàn)象，當(dāng)總應(yīng)變保持不變時(shí)，組織內(nèi)部的變形恢復(fù)力(回彈應(yīng)力)會(huì)隨時(shí)間逐漸降低[16]。

壓痕實(shí)驗(yàn)是一種用于表征固體粘彈性的可靠方法，在表征生物材料力學(xué)特性方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)[15，17-18]。此實(shí)驗(yàn)應(yīng)用既往研究中已形成的理論，通過球形壓頭和離體肝臟組織接觸并加壓使其產(chǎn)生形變后(實(shí)驗(yàn)壓頭直徑3.5 mm，肝臟模型被壓下約1 μm)，保持壓頭不動(dòng)，由下方壓力傳感器測(cè)量壓力變化，獲得載荷—位移曲線，從而得到可用于描述組織粘彈性特性的相關(guān)參數(shù)，即松弛時(shí)間(s)(t1，t2)，表示其在形變一定的情況下，組織內(nèi)部應(yīng)力降低的時(shí)間，t1為應(yīng)力下降開始時(shí)間，t2為應(yīng)力降低到平衡時(shí)的時(shí)間[15，19]；應(yīng)力松弛程度(g1，g2)，表示組織內(nèi)部應(yīng)力降低的程度，g1為下降開始時(shí)的變化程度，g2為降低到平衡時(shí)的變化程度。實(shí)驗(yàn)儀器以及粘彈性參數(shù)獲取過程如圖1所示。

圖1 壓痕實(shí)驗(yàn)示意圖

1.6 肝臟粘彈性測(cè)定

在壓痕實(shí)驗(yàn)過程中，本研究選擇SD大鼠離體肝臟中2個(gè)較大的肝葉，即肝左外側(cè)葉(left lateral lobe，LLL)和肝中葉(median lobe，ML)，并對(duì)每個(gè)肝葉各進(jìn)行2次獨(dú)立測(cè)試，在每個(gè)SD大鼠離體肝臟各獲得4組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，取其平均值作為該肝臟的最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中的環(huán)境溫度和濕度分別約為25 ℃和50%，實(shí)驗(yàn)用肝臟以及選取實(shí)驗(yàn)點(diǎn)位置如圖2所示。

1.7 肝臟病理檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)點(diǎn)處的肝臟組織剪下，固定于10%的福爾馬林液體中，于24 h更換福爾馬林液，72 h取出，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色。肝臟脂肪變性程度參照脂肪肝病理診斷Brunt分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[20]。

表1 壓痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 壓痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：表中t1為應(yīng)力下降開始時(shí)間(秒)，t2為應(yīng)力降低到平衡時(shí)的時(shí)間(秒)；應(yīng)力松弛程度(g1，g2)表示組織內(nèi)部應(yīng)力降低的程度，g1為下降開始時(shí)的變化程度，g2為降低到平衡時(shí)的變化程度。

參數(shù) S0組(7只) S1組(7只) S2組(10只) S3組(10只)g1 0.453±0.034 0.483±0.023 0.482±0.023 0.453±0.027 g2 0.228±0.008 0.215±0.007 0.240±0.026 0.235±0.014 t1(s) 0.520±0.090 0.481±0.043 0.551±0.103 0.599±0.068 t2(s) 24.410±2.302 24.781±1.926 28.666±2.120 31.577±2.110

圖2 大鼠肝臟圖及實(shí)驗(yàn)點(diǎn)選取示意圖

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Excel表格建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，粘彈性參數(shù)與大鼠脂肪肝程度的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果

動(dòng)物模型共40只，獲得病理結(jié)果前，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各死亡3只。將SD大鼠肝臟進(jìn)行病理分析后，根據(jù)脂肪肝病理診斷Brunt分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將剩余36只SD大鼠重新分組，最終得到S0組7只，S1組7只，S2組10只，S3組10只，如如圖3所示。

圖3 SD大鼠最終分組數(shù)量及不同程度脂肪變性肝臟的病理切片圖(×40)

2.2 SD大鼠肝臟粘彈性參數(shù)一般情況

SD大鼠肝臟的粘彈性參數(shù)都通過壓痕實(shí)驗(yàn)獲得，4個(gè)粘彈性參數(shù)分別以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。SD大鼠肝臟的松弛程度(g1)測(cè)值范圍為0.426～0.506；松弛程度(g2)測(cè)值范圍為0.208～0.266；松弛時(shí)間(t1)測(cè)值范圍為0.438～0.667；松弛時(shí)間(t2)測(cè)值范圍為22.108～33.687(見表1)。

2.3 粘彈性參數(shù)與大鼠脂肪肝程度相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，SD大鼠肝臟脂肪變性程度與松弛時(shí)間(t1，t2)呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.405，r=0.802；p＜0.05)；其中，與松弛時(shí)間(t2)相關(guān)性更好；肝臟脂肪變性程度與應(yīng)力松弛程度(g1，g2)均不相關(guān)，見表2。

表2 Pearson相關(guān)分析結(jié)果

3 討論

NAFLD的早期診斷對(duì)臨床工作有著重要意義，該病變基礎(chǔ)是脂滴在肝細(xì)胞內(nèi)堆積進(jìn)而造成肝臟代謝和功能異常[7，20-21]。近年來，超聲彈性成像被廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的診斷，對(duì)其在脂肪性肝病中的應(yīng)用也有報(bào)道[22-26]。在過去的20年中，已經(jīng)形成了數(shù)種超聲彈性成像方法。其中剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE)使用最為廣泛，因其能夠定量地表征肝組織的彈性特征[27]。在該方法假設(shè)組織是純彈性體，通過測(cè)量剪切波速(shear wave velocity，SWV)，應(yīng)用公式：E=3ρSWV2(其中ρ表示組織密度)來計(jì)算組織彈性模量(用E表示)[11-12]。然而，所有生物組織都具有粘彈性，單純測(cè)量其彈性特征有一定的局限性[13-14]。

以往為了彌補(bǔ)此方法的缺陷，研究者們對(duì)NAFLD發(fā)展過程中肝臟的粘彈性變化進(jìn)行了不斷探索。Barry等[13]對(duì)70只小鼠的肝臟進(jìn)行了離體實(shí)驗(yàn)，并得出利用爬行波的頻散可以反映組織粘彈性，并用于區(qū)分肝臟脂肪變性的程度。此外，一項(xiàng)研究用動(dòng)態(tài)力學(xué)分析(dynamic mechanical analysis，DMA)方法來評(píng)估體外大鼠模型的肝組織粘彈性，也證明肝組織粘彈性與脂肪變性程度相關(guān)[28]。然而，Nightingale等[29]利用剪切波頻散原理，對(duì)135名NAFLD患者進(jìn)行了肝臟粘彈性測(cè)定，研究結(jié)果顯示，未觀察到粘彈性參數(shù)與不同的脂肪變性階段之間的相關(guān)性。

本研究表明，出現(xiàn)這種結(jié)果不統(tǒng)一的主要原因是由于DMA中使用的正弦負(fù)載的頻率通?！?0 Hz，而剪切波的頻率通常在數(shù)百赫茲的數(shù)量級(jí)?；诖?，結(jié)合DMA和剪切波頻散分析都顯示出評(píng)估肝臟脂肪變性階段的粘彈性特征的局限性，本研究旨在探究脂肪肝粘彈性在壓痕實(shí)驗(yàn)的時(shí)間尺度(秒級(jí))是否有相關(guān)性[15，30]。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究結(jié)果顯示，肝臟脂肪變性程度與松弛時(shí)間(t1，t2)呈正相關(guān)，其中，與反映組織內(nèi)部應(yīng)力降低到平衡時(shí)的時(shí)間(t2)相關(guān)性更好。

本研究尚有不足之處：①通過壓痕松弛實(shí)驗(yàn)來獲得離體肝臟的粘彈性參數(shù)，這種有創(chuàng)診斷方法仍處于研究階段，不適于在此階段直接應(yīng)用于臨床。然而近期有學(xué)者提出了基于超聲的松弛和(或)蠕變實(shí)驗(yàn)[28-31]借助于該方法，未來可以將壓痕實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于臨床；②NAFLD包括一系列臨床和組織病理學(xué)變化，包括單純性脂肪變性，伴有炎癥的脂肪變性，脂肪性肝炎，肝硬化和肝細(xì)胞癌[32]。本研究中，SD大鼠肝臟脂肪變性模型未出現(xiàn)明顯的炎癥和纖維化，因此，炎癥和纖維化如何影響肝組織的粘彈性仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

在本研究中，應(yīng)用壓痕實(shí)驗(yàn)來評(píng)估NAFLD大鼠模型中肝組織的粘彈性，其結(jié)果表明，隨著肝臟脂肪變性程度的增加，粘彈性參數(shù)松弛時(shí)間(t1，t2)與非酒精性肝臟脂肪變性程度顯著相關(guān)。此發(fā)現(xiàn)為脂滴在肝臟中堆積進(jìn)而影響肝臟機(jī)械特性的現(xiàn)象提供了新的信息，并可能有助于早期診斷NAFLD。