麻海瀾，孫虎芝，任慧英，張 燦

(青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，青島 266109)

噬菌體是一種專性寄生于細菌的病毒，作為細菌的天敵，在自然界中廣泛存在，其數(shù)量達1031個[1]。在19世紀初，噬菌體曾廣泛用于細菌病的防治，隨后抗生素的發(fā)現(xiàn)及其廣譜抗菌特性導致各國噬菌體的研究工作停滯。然而近年來，細菌耐藥情況日益嚴重，新型抗生素發(fā)現(xiàn)和開發(fā)進程進展緩慢，人們注意到使用抗生素存在著不可忽視的缺陷[2-3]。因此，噬菌體作為抗生素替代品又重新引起關(guān)注[4-5]。噬菌體裂解細菌特異性強，且不受細菌耐藥性限制，已成為科學研究的熱點，廣泛應(yīng)用于病原體檢測、食品和環(huán)境消毒、細菌性疾病防控等領(lǐng)域[6-7]。

噬菌體種類繁多，其中T-even類(T2、T4、T6等)噬菌體能夠裂解腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌。目前GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄了300多種能夠裂解大腸桿菌的噬菌體，其中37種屬于T4類噬菌體[8]。T4類噬菌體屬于有尾噬菌體科，其尾部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括基板、6個短尾絲和6個長尾絲[9]。在感染宿主菌過程中，T4類噬菌體長尾絲末端的受體識別蛋白能夠識別并吸附宿主菌表面受體，啟動噬菌體侵染過程[10-11]。T4類噬菌體長尾絲的受體識別蛋白主要有兩種：在T4噬菌體中，gp37蛋白位于長尾絲末端，在伴侶分子gp57和gp38的作用下形成三聚體結(jié)構(gòu)，是識別受體的關(guān)鍵蛋白[12-13]；在T2和T6噬菌體中，gp38蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白與gp37相鄰，位于長尾絲末端，是識別受體的關(guān)鍵蛋白[14]。

筆者在前期研究工作中分離到一株雞源大腸桿菌噬菌體Bp7，基因組測序結(jié)果顯示其屬肌尾噬菌體科T4類噬菌體[15-16]。為了檢測噬菌體Bp7的gp38蛋白在噬菌體吸附宿主菌過程中的作用，本試驗在原核系統(tǒng)表達gp38蛋白，分析其序列特征，測定其生物學活性，并對其進行噬菌體表面定位，以期為明確噬菌體Bp7的吸附機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 噬菌體及其宿主菌 噬菌體Bp7為雞源大腸桿菌噬菌體，屬肌尾噬菌體科，T4類噬菌體，已完成基因組測序(GenBank登錄號：NC_019500.1)，由青島農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室保存。宿主菌為E.coliK12，用于噬菌體Bp7的增殖，由青島農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室保存。

1.1.2 引物及主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和His-Ni蛋白純化柱購自康為世紀有限公司。根據(jù)噬菌體Bp7基因組注釋的gp38基因序列，設(shè)計gp38上、下游引物，序列分別如下，gp38F：5′-CAGGAGCTCATGGCAGTAGTAGGAAT-3′, gp38R：5′-GGGCTCGAGTTAA-TACTTTCGTATTAT-3′(下劃線分別表示限制性酶切位點SacⅠ和XhoⅠ),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體Bp7蛋白gp38序列分析 根據(jù)噬菌體Bp7全基因組注釋信息，獲得預(yù)測的gp38氨基酸序列，與NCBI網(wǎng)站GenBank中已登錄的其他噬菌體尾絲蛋白gp38序列進行同源性比對，分析噬菌體Bp7蛋白gp38與其他噬菌體的親緣關(guān)系；選取相似性較高的7個序列及有代表性的2個序列，利用DNAman軟件對尾絲蛋白gp38的氨基酸序列進行保守區(qū)域分析，闡明其序列特征。選取的序列及其GenBank登錄號分別為Shf125875(YP_009100789.1)、vB_EcoM_VR5(YP_009205945.1)、RB51(YP_002854204.1)、RB69(NP_861945.1)、PHAPEC2(YP_009056827.1)、JS10(YP_002922591.1)、JS98(YP_001595373.1)、T6(AAC61977.1)、T2(CAA28935.1)。

1.2.2gp38基因的克隆及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 以 噬菌體Bp7基因組DNA為模板， PCR擴增gp38基因，預(yù)期目的基因大小為780 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min， 35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將鑒定正確的基因片段插入原核表達載體pColdTF中，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pColdTF-gp38，分別進行PCR和雙酶切鑒定，測序。

1.2.3 重組蛋白gp38的表達及抗體制備 鑒定正確的重組質(zhì)粒pColdTF-gp38轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21，制備可表達gp38蛋白的工程菌pColdTF-gp38/BL21。挑取單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg·mL-1氨芐青霉素)，16 ℃條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0.6 mmol·L-1的IPTG誘導表達12 h，4 000 r·min-1離心10 min收集菌體沉淀，PBS洗滌3次，重懸菌體。超聲裂解菌體，分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達形態(tài)，親和層析法純化蛋白，進行Western blot鑒定[17]。鑒定正確的純化蛋白gp38免疫家兔，4免后收集血清，瓊擴試驗檢測蛋白gp38抗體效價。

1.2.4 重組蛋白gp38在噬菌體表面的定位分析 10 μL 噬菌體Bp7增殖液與10 μL gp38抗血清混勻，4 ℃條件下孵育4 h。取10 μL孵育液滴加于銅網(wǎng)上，吸附10 min，PBS洗滌3次。磷鎢酸染色 3 min, 自然干燥后，電鏡觀察gp38蛋白在噬菌體Bp7表面的定位。

1.2.5 重組蛋白gp38 的受體識別活性分析 將200 μL過夜培養(yǎng)的宿主菌E.coliK12與200 μL純化蛋白gp38(0.2 mg·mL-1)混勻，在37 ℃條件下孵育10 min，同時以等量PBS代替純化蛋白作為對照。加入100 μL適宜濃度的噬菌體Bp7增殖液，37 ℃條件下作用5 min，雙層平板法檢測噬菌斑生長情況。對照組和試驗組各設(shè)3個重復(fù)。根據(jù)噬菌斑數(shù)量計算噬菌體Bp7相對吸附率，檢測尾絲蛋白gp38競爭抑制噬菌體Bp7吸附宿主菌E.coliK12作用。

取100 μL適宜濃度的噬菌體Bp7增殖液，加入100 μL gp38抗血清混勻，同時設(shè)陰性血清為對照，在37 ℃條件下孵育10 min。加入200 μL新鮮增殖的E.coliK12菌液混勻，37 ℃條件下作用5 min， 雙層平板法檢測噬菌斑生長情況。對照組和試驗組各設(shè)3個重復(fù)。根據(jù)噬菌斑數(shù)量計算噬菌體Bp7相對吸附率，檢測gp38蛋白抗體阻斷噬菌體Bp7吸附宿主菌E.coliK12作用。

噬菌體相對吸附率=試驗組噬菌斑數(shù)/對照組噬菌斑數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體Bp7蛋白gp38序列分析

噬菌體Bp7蛋白gp38氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他噬菌體的gp38序列進行相似性比對，結(jié)果顯示噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38序列與T4類噬菌體尾絲蛋白序列相似性高，其中與噬菌體Shf125875的尾絲蛋白氨基酸序列相似性最高(97%)，與噬菌體T6、T2的相似性較低(59%、33.9%)，與T4噬菌體無同源性。根據(jù)相似性比對結(jié)果，選取相似性較高的序列，對噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38進行進化分析，結(jié)果見圖1。噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38與其他7株噬菌體親緣關(guān)系較近，同屬一個進化分支，與另外4個分支的噬菌體遺傳距離較遠。

用DNAman軟件對噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38及其親緣關(guān)系較近的7株噬菌體gp38蛋白序列以及有代表性的T2、T6噬菌體gp38蛋白序列進行比對，結(jié)果見圖2。由圖2可知，gp38蛋白N端序列保守性相對較強，C端序列高度變異。在C端存在4個高度保守的富甘氨酸保守區(qū)(glycine-rich motifs, GRM)，將C端序列分割成五個高變區(qū)(hypervariable segments, HVS)，呈現(xiàn)出馬賽克特征。

2.2 gp38基因的克隆及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以噬菌體Bp7的基因組序列為模板，設(shè)計引物，PCR擴增目的基因gp38，測序結(jié)果表明獲得了正確的gp38基因產(chǎn)物。將鑒定正確的gp38基因片段插入原核表達載體pColdTF中構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pColdTF-gp38，進行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3。由圖可知，在大約780 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段大小相同。

2.3 重組蛋白gp38 的表達及鑒定

重組質(zhì)粒pColdTF-gp38轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，IPTG低溫誘導，進行SDS-PAGE電泳檢測和Western blot鑒定，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在85 ku 左右出現(xiàn)預(yù)期目的條帶，蛋白在上清中表達量較高，為可溶性表達。親和層析法純化蛋白后，免疫家兔，4免后采血，檢測血清中抗體效價達1∶16。

圖1 尾絲蛋白gp38序列同源性分析
Fig.1 Homology analysis of gp38 amino acid sequence

圖2 尾絲蛋白gp38氨基酸序列特征分析
Fig.2 Character analysis of gp38 amino acid sequence

M.DNA相對分子質(zhì)量標準(DL2000); 1. pColdTF-gp38 PCR擴增; 2. pColdTF-gp38雙酶切鑒定
M. DNA marker (DL2000); 1. PCR product of pColdTF-gp38; 2. Double enzyme digestion product of pColdTF-gp38
圖3 pColdTF-gp38的PCR與雙酶切鑒定
Fig.3 PCR and double enzyme digestion products of recombined plasmid pColdTF-gp38

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準; 1. pColdTF-gp38/BL21菌體裂解沉淀; 2. pColdTF-gp38/BL21菌體裂解上清; 3. 重組質(zhì)粒pColdTF-gp38的誘導表達; 4. 空載體質(zhì)粒pColdTF的誘導表達; 5. gp38蛋白Western blot檢測
M. Protein marker; 1. The precipitation of pColdTF-gp38/BL21; 2. The supernatant of pColdTF-gp38/BL21; 3. The expression of recombinant plasmid pColdTF-gp38; 4. The expression of plasmid pColdTF; 5. Western blot of gp38 protein
圖4 重組蛋白gp38的SDS-PAGE及Western blot鑒定
Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombined protein gp38

2.4 重組蛋白gp38在噬菌體表面的定位

利用尾絲蛋白gp38制備的抗血清與噬菌體Bp7相互作用后，進行免疫電鏡觀察，結(jié)果見圖5。由圖5可知，加入gp38蛋白的抗血清后，噬菌體Bp7的長尾絲相對，聚集在一起，說明gp38蛋白的抗血清能夠與噬菌體Bp7的長尾絲結(jié)合，引起噬菌體的聚集，表明蛋白gp38位于噬菌體Bp7的尾絲末端，是尾絲蛋白的組成部分。

2.5 重組蛋白gp38 的受體識別活性分析

gp38蛋白與E.coliK12孵育后，加入噬菌體Bp7，檢測噬菌體Bp7吸附宿主菌E.coliK12的效果，結(jié)果見圖6。由圖6可知，gp38蛋白組噬菌體Bp7相對吸附率為0，說明gp38蛋白能夠與E.coliK12表面受體結(jié)合，使噬菌體Bp7不能結(jié)合到宿主菌表面受體，完全競爭抑制噬菌體Bp7對宿主菌E.coliK12的吸附。

圖5 重組蛋白gp38 免疫電鏡觀察
Fig.5 Immuno-electron microscope observation of
recombined protein gp38

圖6 gp38蛋白抑制噬菌體Bp7吸附作用
Fig.6 gp38 protein inhibits the adsorption of phage Bp7

gp38抗血清與噬菌體Bp7孵育后，加入宿主菌E.coliK12，檢測噬菌體Bp7吸附效果，結(jié)果見圖7。由圖7可知，gp38抗血清組噬菌體Bp7相對吸附率為0，說明gp38抗血清能夠與噬菌體Bp7的蛋白gp38特異性結(jié)合，從而對噬菌體起到封閉作用，使噬菌體尾絲蛋白無法識別宿主菌的受體，完全阻斷噬菌體Bp7對宿主菌E.coliK12的吸附。

圖7 gp38抗血清阻斷噬菌體Bp7吸附作用
Fig.7 Antiserum of gp38 protein blocks the adsorption of phage Bp7

3 討 論

噬菌體作為細菌的天敵，具有潛在的開發(fā)價值和廣闊的應(yīng)用前景，近年來備受關(guān)注[18-19]。有尾噬菌體gp38蛋白在不同的噬菌體中具有不同的作用。在T4噬菌體中，gp38作為伴侶分子，保證受體識別蛋白gp37形成正確的三聚體空間構(gòu)象，而在T2、T6噬菌體中，gp38是關(guān)鍵的受體識別蛋白[20]。本試驗對噬菌體Bp7的gp38蛋白開展研究，明確其在噬菌體Bp7吸附過程中的作用。

噬菌體Bp7是一株從雞場分離的大腸桿菌噬菌體，具有寬宿主譜的特征，屬于肌尾噬菌體科、T4類噬菌體，與T4噬菌體全基因組序列相似性達76.56%[15]。但是，本試驗噬菌體Bp7蛋白gp38氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)其與T4噬菌體gp38蛋白幾乎沒有同源性，而與T2、T6噬菌體的親緣關(guān)系較近。對其序列特征進一步分析發(fā)現(xiàn)， gp38蛋白序列C端變異程度高，4個GRM區(qū)與5個HVS區(qū)間隔排列，呈現(xiàn)出馬賽克特征，這與之前對gp38序列報道結(jié)果一致[20]。因此，可以推測噬菌體Bp7蛋白gp38與T2、T6噬菌體的gp38蛋白相似，可能作為受體識別蛋白在噬菌體吸附宿主菌過程中具有關(guān)鍵作用。本試驗在原核系統(tǒng)中可溶性表達了噬菌體Bp7蛋白gp38，并制備了相應(yīng)多克隆抗體。gp38蛋白競爭抑制試驗及抗體阻斷試驗證實，兩者均能完全阻止噬菌體Bp7的吸附過程，這表明gp38蛋白在噬菌體Bp7吸附過程中具有關(guān)鍵作用。同時，通過免疫電鏡觀察，gp38抗體能夠與噬菌體Bp7長尾絲結(jié)合，引發(fā)噬菌體聚集，說明gp38蛋白位于噬菌體Bp7的長尾絲末端，這表明噬菌體Bp7蛋白gp38與T2噬菌體尾絲蛋白gp38功能相似，是噬菌體Bp7關(guān)鍵的受體識別蛋白。

本試驗證實尾絲蛋白gp38在噬菌體Bp7識別宿主菌過程中具有重要作用，gp38蛋白特征決定了其能夠吸附宿主菌受體的種類，進而決定了噬菌體Bp7的宿主譜。Drexler等[21]推測GRM構(gòu)成gp38蛋白的結(jié)構(gòu)核心，HVS形成Ω環(huán)，識別宿主菌表面受體。對不同噬菌體gp38的序列比對發(fā)現(xiàn)與HVS序列相似的噬菌體其宿主范圍相同，利用同源重組替換HVS序列可以改變噬菌體宿主譜，這進一步證實了HVS序列是gp38的受體結(jié)合區(qū)域[20]。因此，尾絲蛋白gp38的HVS結(jié)構(gòu)特征決定了噬菌體Bp7識別受體的種類，進而決定了噬菌體Bp7寬宿主譜的特征，但是gp38蛋白的HVS識別受體的作用機制尚不明確，將在后續(xù)工作中進行深入研究。

4 結(jié) 論

噬菌體Bp7蛋白gp38位于長尾絲末端，是噬菌體的受體識別蛋白，在噬菌體識別與吸附宿主菌E.coliK12表面受體過程中具有關(guān)鍵作用，這為后期闡明寬宿主譜噬菌體Bp7識別受體的作用機制提供了理論基礎(chǔ)。