寸靜宇 ，劉秋月 ，王翔宇 ，狄 冉 ，胡文萍 ，張效生 ，張金龍 ，趙永聚 ，儲(chǔ)明星

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400715；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

多羔性狀是影響綿羊養(yǎng)殖業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，所以提高每胎的產(chǎn)羔數(shù)是提升羊生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益的重要措施［1］。而綿羊多羔性狀候選基因的研究對(duì)于提高綿羊產(chǎn)羔性狀具有重要意義［2］。隨著科技進(jìn)步及許多與綿羊多羔性狀相關(guān)的候選基因的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［3］，在生產(chǎn)中利用分子標(biāo)記對(duì)綿羊多羔性狀的基因型選擇取得了很大進(jìn)展。

促卵泡激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）屬于糖蛋白類促性腺激素，是控制哺乳動(dòng)物生殖的核心激素，由垂體合成分泌并通過外周血液循環(huán)作用于其卵巢中的受體（FSHR）來調(diào)控個(gè)體繁殖過程［4］。FSHR主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞中，其表達(dá)水平與顆粒細(xì)胞的分化、卵泡閉鎖及成熟密切相關(guān)［5］。朱吉等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在貴州黑山羊中，F(xiàn)SHR基因的表達(dá)水平對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的影響達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），由此推斷，F(xiàn)SHR基因可能是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的候選基因。胡亮等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在多羔的金堂黑山羊卵巢中，F(xiàn)SHR基因mRNA的表達(dá)水平高于單羔的藏山羊（P＞0.05），金堂黑山羊的卵泡對(duì)FSH的敏感性高，這可能也是影響山羊高排卵數(shù)的重要機(jī)制。

鑒于此，本試驗(yàn)在小尾寒羊群體中，使用Taqman探針法對(duì)FecB基因進(jìn)行分型，經(jīng)過連續(xù)觀察并記錄產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)（產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)均大于或等于2，則定義為多羔），確定了小尾寒羊FecB基因突變++型中產(chǎn)單羔和產(chǎn)多羔的個(gè)體，并以此為研究對(duì)象，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)FSHR基因在生殖軸相關(guān)組織中的表達(dá)情況，以探討FSHR基因表達(dá)與小尾寒羊（STH）產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，為小尾寒羊多羔性狀的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品及主要試劑

隨機(jī)選取3周歲健康狀況良好的小尾寒羊母羊6只（FecB++型單羔和多羔各3只），飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)羊場(chǎng)。用孕酮陰道栓（CIDR）對(duì)6只小尾寒羊進(jìn)行處理，12 d后撤栓，在撤栓后45 h屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體7種組織，液氮中保存，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRTReagent Kit）和熒光定量染料（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）均購(gòu)于TaKaRa公司（大連）。

1.2 RNA提取

用Trizol和RNAprep pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述組織總RNA。利用Nanodrop 2000檢測(cè)所提取的總RNA濃度和OD值，并用1.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，置于-80℃冷凍備用。

1.3 cDNA合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL，具體見表1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃5 s，獲得cDNA第一鏈。全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋，用持家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測(cè)，可成功擴(kuò)增。將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20℃保存，以用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

1.4 定量引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的綿羊FSHR基因mRNA序列（登錄號(hào)為：NM_001009289.1），利用 Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以β-actin（NM_001009784.2）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物名稱和序列以及擴(kuò)增片段大小見表2。

表2 熒光定量引物信息

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量檢測(cè)采用Roche Light Cycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。反應(yīng)體系總體積為20 μL，具體見表3。PCR 程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5 s，95℃變性 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），用最小顯著差異法（Least significant difference，LSD）進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成

使用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取小尾寒羊各組織的RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，電泳條帶明亮清晰、整齊、無拖尾；以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對(duì)β-actin進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的β-actin引物擴(kuò)增效果良好（圖1），目的片段與預(yù)期的97 bp一致，且條帶單一，可以用于后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

圖1 cDNA電泳檢測(cè)

2.2 綿羊FSHR基因在小尾寒羊（多羔和單羔）繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)FSHR基因在大腦、小腦、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管和垂體組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：FSHR基因主要集中在卵巢、大腦、垂體組織中表達(dá)。FSHR基因在小尾寒羊多羔群體卵巢和垂體組織中的表達(dá)量均極顯著高于小尾寒羊單羔群體（P＜0.01）。

圖2 FSHR基因在小尾寒羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

3 討論

在人類和動(dòng)物的生殖活動(dòng)中，F(xiàn)SHR是重要的媒介［8］。FSHR主要表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞中，其表達(dá)水平與顆粒細(xì)胞的分化、卵泡閉鎖及成熟密切相關(guān)。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞綿羊［4］、母馬［9］和貓［10］等動(dòng)物的卵巢中FSHRmRNA表達(dá)方面做了大量研究。然而，F(xiàn)SHR除了在卵巢中表達(dá)外，研究者也發(fā)現(xiàn)在非性腺組織中表達(dá)。本研究對(duì)小尾寒羊下丘腦-垂體-卵巢軸相關(guān)組織FSHR表達(dá)進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在小尾寒羊中主要集中在卵巢、大腦、垂體組織中表達(dá)，其中在卵巢高表達(dá)，這與前人的研究結(jié)果相一致。龍威海等［11］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在黔北麻羊、貴州白山羊和貴州黑山羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5種組織中均有表達(dá)；Huo等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情期的牦牛，F(xiàn)SHR主要在垂體和卵巢中表達(dá)。而本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR只在小尾寒羊的卵巢、大腦和垂體3種組織中表達(dá)，推測(cè)可能是因?yàn)槲锓N差異。另外，Chen等［13］通過蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在牦牛的子宮環(huán)肌層、上皮細(xì)胞和固有層中表達(dá)，在輸卵管的粘膜皺襞中表達(dá)，在卵巢的顆粒層表達(dá)，所以本研究與前人研究的差異也可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)前期的采樣過程中，并未采集到基因在組織中高表達(dá)的部位。本研究中，產(chǎn)多羔的小尾寒羊FSHR在卵巢和垂體的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)單羔的小尾寒羊（P＜0.01），這與Goyal等［14］和龍威海等［11］的研究結(jié)果相一致，推測(cè)小尾寒羊的繁殖性能受到FSHR的調(diào)控，F(xiàn)SHR在繁殖相關(guān)組織的基因表達(dá)量可能與綿羊產(chǎn)多羔性狀有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因的表達(dá)與小尾寒羊產(chǎn)羔性狀存在一定程度的正相關(guān)，暗示其可能參與了小尾寒羊多羔性狀調(diào)控。深入研究該基因功能對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀的選育具有一定的參考意義。