王 銳，劉亞東，于時(shí)良，任 昌，安瑞華

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

腎結(jié)石是泌尿外科常見疾病之一。結(jié)石形成后在局部反復(fù)刺激上皮細(xì)胞促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[1-2]。腎結(jié)石絕大多數(shù)為草酸鈣(calcium oxalate，Ca Ox)結(jié)石，因此構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)石模型對研究抗腎纖維化機(jī)制就更具有普遍意義[3]。高草酸尿是草酸鈣腎結(jié)石的主要危險(xiǎn)因素之一，可對腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生損傷，促進(jìn)結(jié)石的滯留和粘附[4-6]。

草酸結(jié)晶可通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)/Smads途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生[5]。MG132是一種醛基肽類泛素-蛋白酶體抑制劑，可抑制蛋白的泛素化活性，并能以劑量依賴方式抑制TGF -β1 誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖[5]。本文從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面多個(gè)角度闡述MG132可抑制EMT的形成及減少細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1材料高糖改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)合成液體培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，MG132蛋白酶體抑制劑(美國Sigma公司)，兔抗人上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)、兔抗人N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)單克隆抗體、兔抗人Smad7單克隆抗體、兔抗人TGFβ1單克隆抗體(美國Abcam公司)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體(上海碧云天公司)，活性氧檢測試劑盒2′-,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′-,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH -DA)(中國碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)犬遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞馬丁達(dá)比狗腎(madin-darby canine kidney，MDCK)由本實(shí)驗(yàn)室保存。將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2的溫度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞生長至覆蓋率為80%左右時(shí)予以藥物草酸和MG132干預(yù)。研究共分為3組：正常對照組、草酸干預(yù)組(Oxalate組)、草酸+MG132干預(yù)組(Ox+MG132組)。

1.3Westernblot細(xì)胞模型構(gòu)建完成后提取蛋白，采用蛋白定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)配制后依次電泳、電轉(zhuǎn)，用含5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h、孵育E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGFβ1、Smad7抗體1 h，4 ℃冰箱過夜。次日以含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with tween-20，PBST)洗滌后用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h，再次用PBST洗滌后將聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜放入Bio-Rad成像儀，選擇合適的參數(shù)，滴加電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence，ECL)發(fā)光液后進(jìn)行顯影，對結(jié)果運(yùn)用Image Lab軟件分析處理。

1.4活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)檢測細(xì)胞種植于6孔板中，待細(xì)胞生長覆蓋率達(dá)到80%左右時(shí)，予以草酸和MG132干預(yù)2 h。誘導(dǎo)完畢后，胰酶消化細(xì)胞離壁至離心管中。離心后加入含DCFH-DA探針的無血清培養(yǎng)液將離心管中細(xì)胞重懸，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，期間每間隔3～5 min吹打混合一次。然后各組取相同數(shù)目的細(xì)胞重懸于500 uL的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中。再用200目濾網(wǎng)過濾轉(zhuǎn)移至流式碧迪醫(yī)療(becton dickinson，BD)管中，適度搖勻后上機(jī)檢測。結(jié)果用流式分析軟件分析計(jì)算，所有實(shí)驗(yàn)操作均3次以上。

1.5細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)水平的測定SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡有重要作用，其可以清除超氧陰離子自由基從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。由黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，在550 nm處用酶標(biāo)儀測其吸光度。計(jì)算公式為0.5×(對照吸光度A值-測定A值)/(對照A值)×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1ROS發(fā)生率流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)(圖1、圖2)，草酸組較正常組ROS發(fā)生率增加4倍左右。而與草酸組相比，MG132組會(huì)降低草酸誘導(dǎo)所產(chǎn)生的ROS。

圖1各組干預(yù)后ROS的發(fā)生率(%)

A:正常對照組；B：Oxalate組；C：Ox+MG132組。

圖2 各組干預(yù)后活性氧表達(dá)量柱形圖*與Oxalate組比較，P<0.01。

2.2EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)各組蛋白表達(dá)具體結(jié)果見圖3A,與正常組相比， Vimentin、N-cadherin表達(dá)升高，而MG132干預(yù)后上述蛋白的表達(dá)量會(huì)降低；而E-cadherin表達(dá)與間質(zhì)蛋白表達(dá)量完全相反(圖3B、C、E)。

2.3TGFβ1/Smads通路相關(guān)蛋白的表達(dá)TGFβ1蛋白在草酸干預(yù)后表達(dá)量增加，而MG132會(huì)減弱這種影響。而Smad7負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGFβ1的表達(dá)，3組間該蛋白的表達(dá)量與TGFβ1相反(圖3D、F)。

圖3E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、TGFβ1、Smad7蛋白的表達(dá)

A：E-cadherin、N-cadherin、TGFβ1、Vimentin、Smad7蛋白表達(dá)條帶圖；B：上皮鈣黏蛋白表達(dá)水平柱狀圖；C:N -鈣黏著蛋白表達(dá)水平柱狀圖；D:轉(zhuǎn)化生長因子β1表達(dá)水平柱狀圖；E：波形蛋白表達(dá)水平柱狀圖；F:Smad7蛋白表達(dá)水平柱狀圖。*：與Oxalate組相比(P<0.05)。

2.4SOD表達(dá)量草酸損傷腎小管上皮細(xì)胞，MG132組因可緩解草酸所帶來的損傷，故草酸組SOD的表達(dá)量均低于正常、MG132干預(yù)組(圖4)。

圖4 超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)量*與Oxalate組相比，P<0.05。

3 討 論

泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system，UPS)是細(xì)胞內(nèi)溶酶體外蛋白降解的主要途徑之一，是一種細(xì)胞內(nèi)高效和高度選擇性蛋白降解途徑，已被認(rèn)為是真核細(xì)胞內(nèi)僅次于磷酸化的重要信號調(diào)節(jié)機(jī)制[7]。此外在凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增殖、細(xì)胞表面受體表達(dá)、離子通道調(diào)控、Nrf2降解等許多細(xì)胞基本進(jìn)程中UPS的功能是必要的[8]。MG132是一種肽醛類蛋白酶體抑制劑，目前已經(jīng)作為新的治療靶點(diǎn)和治療策略應(yīng)用于蛋白酶體生物學(xué)[9]。其可以通過抑制蛋白酶體的活性來特異性阻斷UPS介導(dǎo)的蛋白降解，可以通過減少Nrf2的降解發(fā)揮抗氧化作用，低劑量的MG132可促使Nrf2表達(dá)量增加，高劑量的MG132則發(fā)揮相反作用促使細(xì)胞凋亡及發(fā)生氧化應(yīng)激[10]。

EMT是腎間質(zhì)纖維化形成最重要的病理過程，腎間質(zhì)纖維化形成是導(dǎo)致腎功能喪失的最主要的病理生理過程之一[11]。EMT形成的標(biāo)志是腎小管上皮細(xì)胞失去其上皮細(xì)胞表型E-cadherin和vimentin，以此來達(dá)到破壞的腎小管基底膜轉(zhuǎn)位至腎間質(zhì)，分泌Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)增多，從而引起腎間質(zhì)纖維化[11-12]。

Smad7是Smads中的抑制劑，通過抑制Smad2/3的磷酸化來抑制TGF-β信號通路。既往研究發(fā)現(xiàn)破壞Smad7的功能可以加速梗阻性腎病的炎癥和纖維化[13]。此外，由核因子-KB(nuclear factor-kappa B，NF-kB)激活所導(dǎo)致的腎臟纖維化和炎癥也可以經(jīng)過Smad7的表達(dá)而抑制[14]。蛋白酶體抑制劑MG132可減少Smad7的泛素化降解，進(jìn)而可以抑制TGF-β/Smads信號通路的傳遞，通過以劑量依賴的方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖并促其凋亡[15]。

草酸對腎小管細(xì)胞的損傷及促結(jié)石作用主要是其在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致?，F(xiàn)已認(rèn)為，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶是草酸誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要來源[16]。NADPH氧化酶受到TGF-β的調(diào)控[17]。HONG等[18]的研究證實(shí)了阻斷TGF-β1-NADPH-ROS途徑的任意一個(gè)階段均會(huì)抑制ROS的產(chǎn)生，因此，TGF-β1-NADPH-ROS通路是草酸誘導(dǎo)ROS生成的主要途徑。SOD是機(jī)體內(nèi)存在的一種能清除ROS的抗氧化物酶。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MG132可以減少草酸干預(yù)導(dǎo)致的TGF-β1的表達(dá)，并能顯著降低草酸引起的ROS及其相關(guān)損傷后SOD的表達(dá)。故而推測MG132能通過干預(yù)TGF-β1-NADPH-ROS通路來抑制草酸誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生。同時(shí)我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，MG132能降低EMT形成標(biāo)志的蛋白： E-cadherin和 vimentin的產(chǎn)生，加之KANLAYA等[5]發(fā)現(xiàn)草酸鈣結(jié)晶通過TGF-β1 刺激上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，故我們推測MG132是通過抑制TGF-β1/smad通路來介導(dǎo)抑制EMT的產(chǎn)生。但以上兩種推測的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。