李 娟，曹 芳，苗 裔，劉培軍

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710061)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是位于第3位的男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。隨著我國人口老齡化的加劇和飲食結(jié)構(gòu)的改變，前列腺癌已經(jīng)躍升為僅次于肺癌的男性第二大致死性腫瘤[3]。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)已揭示了部分前列腺的易感基因和與其發(fā)展密切相關(guān)的癌基因和抑癌基因，如RNASEL[4]、PTEN[5]、CDN1B[6]、RB[7]和KLF6[8]等。但是，前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有顯著的復(fù)雜性和異質(zhì)性，目前治療手段也相對常規(guī)，缺乏十分有效的靶向性治療。因此，進(jìn)一步研究評估前列腺癌的預(yù)后指標(biāo)及潛在治療靶點(diǎn)是前列腺癌研究的重點(diǎn)。

能量代謝紊亂是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的關(guān)鍵特征[9]。STK11-AMPK激酶是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵感應(yīng)及調(diào)節(jié)激酶[10]，其下游的mTOR信號通路又可調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、染色質(zhì)穩(wěn)定性和細(xì)胞干性等方面[11-12]。因此，我們選取STK11基因作為本文的研究目標(biāo)。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫現(xiàn)已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為評估臨床診斷、預(yù)防和治療的重要武器，鑒于大量的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，可以更加全面和準(zhǔn)確地挖掘出更多與疾病相關(guān)的基因和診斷治療靶點(diǎn)。本研究利用多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫全面分析了STK11基因與PCa臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，揭示其在PCa中的治療和預(yù)測價(jià)值。

1 材料與方法

1.1STK11基因與PCa預(yù)后的關(guān)系GEPIA網(wǎng)站 (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學(xué)開發(fā)的交互式web服務(wù)器，專門分析基因差異表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性。基于該數(shù)據(jù)庫的測序數(shù)據(jù)，我們統(tǒng)計(jì)分析了STK11表達(dá)量與PCa預(yù)后的相關(guān)性。

1.2STK11基因與PCa臨床病理特征的關(guān)系LinkedOmics網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org/login.php)包含了來自TCGA的32種癌癥的多組數(shù)據(jù)。該網(wǎng)站有3個(gè)分析模塊：LinkFinder、LinkInterpreter和LinkCompare。我們利用LinkFinder模塊分析了STK11的mRNA表達(dá)水平與PCa臨床病理特征的關(guān)系。

1.3STK11基因與前列腺癌惡性進(jìn)程的關(guān)系GEO (Gene Expression Omnibus)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/)數(shù)據(jù)庫收錄了大量高通量測序的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其中包括以微陣列為基礎(chǔ)的mRNA豐度測定、基因組DNA和蛋白質(zhì)組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。GEO Profiles數(shù)據(jù)庫是GEO中專門收錄單個(gè)基因在一次試驗(yàn)中的表達(dá)定量數(shù)據(jù)。我們利用該數(shù)據(jù)庫分析了STK11在不同種類前列腺癌中的mRNA表達(dá)水平，探討其在前列腺癌惡性進(jìn)程中的作用。

1.4STK11基因在不同等級PCa組織中的表達(dá)The Human Protein Atlas網(wǎng)站(https://www.proteinatlas.org)包含了基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)、抗體的成像技術(shù)、基于質(zhì)量光譜的蛋白質(zhì)組學(xué)等多種信息，繪制了人類細(xì)胞、組織、器官內(nèi)的所有蛋白質(zhì)。我們引用網(wǎng)站中對不同等級PCa組織的免疫組化結(jié)果，分析了STK11在低等級和高等級PCa組織中的蛋白表達(dá)及定位。

1.5STK11基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是專門研究已知蛋白和預(yù)測蛋白之間相互作用的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫預(yù)測的相互作用包括蛋白之間的直接物理相互作用和間接的功能相互作用。我們引用該網(wǎng)站預(yù)測了與STK11關(guān)系最為密切的10個(gè)相互作用蛋白。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析的STK11表達(dá)量與PCa預(yù)后相關(guān)性的數(shù)據(jù)，利用了Cox回歸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫中分析的STK11的mRNA表達(dá)水平與PCa N分期的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Wilcox檢驗(yàn)；分析的STK11的mRNA表達(dá)水平與PCa T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Kruskal-Waillis檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1STK11表達(dá)與PCa臨床病理特征的相關(guān)性利用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析了STK11基因的mRNA與PCa臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示：STK11的表達(dá)量與T分期(P=0.007，n=490)呈顯著正相關(guān)性(圖1A)，T3型前列腺癌中的STK11表達(dá)量高于T2型前列腺癌；STK11的表達(dá)量與N分期(P=0.000 8，n=424)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)(P=0.002，n=406)呈顯著正相關(guān)性(圖1B、C)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌中STK11表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌，并且隨著轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)的增加，STK11的表達(dá)量也逐漸增加。

圖1STK11表達(dá)與PCa臨床病理特征的相關(guān)性

A：STK11表達(dá)與T分期的關(guān)系(n=490)；B：STK11表達(dá)與N分期的關(guān)系(n=424)；C：STK11表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的關(guān)系(n=406)。

2.2STK11水平與前列腺癌惡性進(jìn)程的關(guān)系利用GEO Profiles數(shù)據(jù)庫分析了不同類型前列腺癌中STK11的mRNA表達(dá)水平。該研究共分析了19例前列腺癌中STK11的mRNA表達(dá)水平，其中良性前列腺組織5例；原發(fā)性前列腺癌組織7例；轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織6例。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：STK11基因在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中表達(dá)量顯著高于良性前列腺組織(P<0.05)和原發(fā)性前列腺癌組織(P<0.01)(圖2)。該結(jié)果提示STK11的高表達(dá)可能在前列腺癌的惡性進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。

圖2 STK11在良性前列腺組織、原發(fā)性前列腺癌組織和轉(zhuǎn)移性列腺癌組織中的表達(dá)

2.3STK11蛋白在PCa組織中的表達(dá)及定位情況利用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫，分析不同等級PCa組織中STK11的表達(dá)及定位水平。該數(shù)據(jù)庫提供的免疫組化結(jié)果表明：STK11在高等級PCa組織中的表達(dá)顯著高于低等級PCa組織，并且主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜(圖3)。

2.4STK11表達(dá)與PCa患者預(yù)后之間的關(guān)系我們利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了STK11表達(dá)與PCa患者預(yù)后之間相關(guān)性，結(jié)果表明：STK11基因的表達(dá)水平對PCa患者的總生存率和無病生存率有顯著影響。與STK11基因高表達(dá)組相比，STK11基因低表達(dá)組的PCa患者其總生存率(LogrankP=0.029，HR=7.3，P(HR)=0.062)和無病生存率均顯著升高(LogrankP=0.001 9，HR=1.9，P(HR)=0.002 3)，如圖4所示。

圖3 The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫提供的STK11蛋白在不同等級PCa組織中的免疫組化染色

3 討 論

隨著人口老齡化的加劇及環(huán)境和飲食結(jié)果的改變，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，現(xiàn)已成為除膀胱癌、腎腫瘤外的第3大常見多發(fā)男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。因此，有關(guān)前列腺癌的診斷、治療和預(yù)防研究已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，但是前列腺癌診治相對復(fù)雜，異質(zhì)性較高。所以，尋找與前列腺癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因?qū)η傲邢侔┬g(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測和治療靶點(diǎn)的研究具有重要的意義。

STK11基因是Pentz-Jeghers綜合癥(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)的關(guān)鍵致病基因，該疾病又稱為黑斑息肉綜合癥，主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜特定部位色素斑和胃腸道多發(fā)性息肉，并且伴隨著多種惡性腫瘤[13-14]。PJS合并的惡性腫瘤多為消化系統(tǒng)腫瘤，但是伴隨著前列腺癌、睪丸癌、腎癌及不確定組織類型的腫瘤[15-19]。因此，我們采用臨床大樣本數(shù)據(jù)庫從STK11基因在PCa中的表達(dá)、與PCa臨床病理特征的相關(guān)性、與PCa預(yù)后的相關(guān)性等方面，全面評估了STK11在PCa診斷與預(yù)后中的重要作用。

在本研究中，我們首先分析了STK11與PCa臨床病理特征之間的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)STK11的表達(dá)分別與T分期、N分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)呈顯著正相關(guān)性。隨后在STK11與PCa惡性進(jìn)程相關(guān)性的分析中發(fā)現(xiàn)，STK11在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達(dá)顯著高于良性前列腺組織和原發(fā)性前列腺組織。而在The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步驗(yàn)證了STK11在不同等級PCa組織中的表達(dá)及定位。最后分析STK11的表達(dá)量是否會(huì)影響PCa患者預(yù)后，結(jié)果表明高表達(dá)STK11的患者其總體生存率與無疾病生存率均顯著低于低表達(dá)STK11者。上述結(jié)果從PCa的臨床病理特征、惡性進(jìn)展和預(yù)后等多方面，全面分析了STK11在前列腺癌中的重要作用。

STK11作為細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵感應(yīng)及調(diào)節(jié)激酶，在基因組穩(wěn)定、細(xì)胞極性及細(xì)胞干性等方面都具有十分重要的作用[10-12]。在乳腺癌中LKB1的低表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，敲低LKB1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和干性[20]。另有研究證明當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受UVB照射時(shí)，LKB1與其下游激酶NUAK1共同磷酸化CDKN1A調(diào)節(jié)DNA的損傷修復(fù)。LKB1缺失將造成CDKN1A積累，DNA修復(fù)受損和凋亡抗性[21]。此外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加，LKB1能夠與cdc42-PAK1(p21 activated kinase 1)結(jié)合，通過激活p38及其下游信號通路增加過氧化物酶和SOD-2兩種抗氧化酶的活性，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧積累造成的損傷[22]。而在子宮內(nèi)膜癌中，LKB1的缺失誘導(dǎo)細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生炎癥趨化因子配體2(CCL2)，該配體能夠招募巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤進(jìn)程[23]。而在現(xiàn)有研究中有關(guān)STK11具體調(diào)節(jié)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。因此，我們利用STING數(shù)據(jù)庫預(yù)測STK11的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步預(yù)測STK11調(diào)控前列腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制(圖5)。

在前十位的STK11潛在靶點(diǎn)中，包含了TP53和SMAD4等與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的重要因子。TP53是一種關(guān)鍵的抗凋亡因子，其通過激活DNA修復(fù)蛋白來維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，同時(shí)引起細(xì)胞周期阻滯和凋亡，此外其還能夠調(diào)控細(xì)胞極性和干性，在腫瘤發(fā)展中具有重要功能[24-25]。SMAD4是介導(dǎo)TGF-β信號通路的關(guān)鍵信號級聯(lián)分子，能夠激活TGF-β1應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化和增殖[26]。因此，STK11有可能通過影響上述關(guān)鍵因子調(diào)控前列腺癌的惡性進(jìn)程。

圖5 STK11的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

綜上所述，STK11在PCa的發(fā)生與發(fā)展中具有重要意義，其可能作為PCa的預(yù)測及治療靶點(diǎn)。