王西西，吳映彤，吳 競(jìng),2，陳鴻軍，郭曉宇，朱鴻飛

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.比利時(shí)列日大學(xué)讓布魯農(nóng)學(xué)院，列日 4000；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病，可導(dǎo)致不同品種、不同年齡段家豬的高致死性出血性疾病[1]，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office international des épizooties，OIE）法定報(bào)告的烈性傳染病之一。與家豬不同，非洲疣豬（warthogs）或叢林豬（bushpigs）感染ASFV后通常無(wú)癥狀，病毒血癥滴度低，可造成持續(xù)感染[2]。ASFV是唯一已知的蟲(chóng)媒DNA病毒，可通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物尤其是乳突鈍緣蜱傳播[2-3]，持續(xù)感染的野豬和軟蜱是家豬感染ASF的重要傳染源[4]。

1921年，肯尼亞首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)ASF[5]，隨后該病在非洲大陸廣泛傳播，現(xiàn)主要在撒哈拉以南的非洲國(guó)家流行。1957年ASFV從非洲傳入歐洲南部國(guó)家并迅速蔓延，葡萄牙、西班牙、意大利等國(guó)家采取了撲殺和嚴(yán)格防控等綜合措施將其撲滅（撒丁島除外）[6]。ASF于2007年傳入高加索地區(qū)以及俄羅斯等國(guó)家，并于2014年傳入歐盟的東部國(guó)家地區(qū)[7-8]。2018年8月3號(hào)，中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷首次報(bào)道我國(guó)出現(xiàn)非洲豬瘟病例，確診沈陽(yáng)市沈北新區(qū)發(fā)生非洲豬瘟疫情，疫點(diǎn)內(nèi)913頭生豬被撲殺和無(wú)害化處理[9]。

ASFV是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的雙股大DNA病毒，為非洲病毒科、非洲病毒屬的唯一成員[10-11]。ASFV基因組長(zhǎng)度約為170～190 kb，表達(dá)150多個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼150～200種蛋白[10]。ASFV基因組結(jié)構(gòu)主要包含約125 kb的中央保守區(qū)、38～47 kb的左側(cè)可變區(qū)和13～16 kb的右側(cè)可變區(qū)[12]。ASFV Georgia 2007/1分離株（ASFV-G）屬于基因II型，基因組大小189 344 bp，表達(dá)166個(gè)開(kāi)放閱讀框[13]。UK(DP96R)基因位于右側(cè)可變區(qū)，在不同病毒毒株基因組中序列高度保守，屬于病毒毒力基因，是導(dǎo)致家豬發(fā)病重要因素之一[14]。已有研究表明，ASFV E70 毒株缺失UK基因后，病毒毒力減弱；ASFV-G毒株雙缺失9GL和UK基因后，可導(dǎo)致病毒毒力下降，免疫基因缺失毒株2周后即可提供部分針對(duì)母本強(qiáng)毒株病毒的免疫保護(hù)力[14-15]。DP96R蛋白是ASFV早期表達(dá)蛋白，在病毒感染巨噬細(xì)胞后2 h即可以檢測(cè)到DP96R蛋白的表達(dá)[14]。本研究通過(guò)合成ASFV UK基因，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化及其多克隆抗體的制備，為后續(xù)DP96R蛋白的血清學(xué)診斷技術(shù)及其生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物pET-28a、pEGFP-N1、pEGFP-N1-UK（UK基因序列已進(jìn)行密碼子優(yōu)化）及 HEK293T細(xì)胞均由北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生創(chuàng)新與管理團(tuán)隊(duì)保存；根據(jù)ASFV Georgia 2007/1 的UK（DP96R）（GenBank登錄號(hào)：FR682468.1）基因序列，由南京金斯瑞生物有限公司合成UK基因并克隆入載體pUC57-simple；1.6～1.8 kg普通級(jí)新西蘭大白兔購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑DMEM、PBS、fetal bovine serum和胰酶購(gòu)自Gibco公司；BamH I/Xho I限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、2×PrimeSTAR? HS DNA Polymerase、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于TaKaRa生物公司；轉(zhuǎn)染試劑Polyplus jet PRIME kit購(gòu)于達(dá)科為公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG購(gòu)自Sigma公司；EGFP-tag和Anti-rabbit IgG (Alexa Fluor? 594 Conjugate)抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司；His-Tag、HRP-conjugated goat Anti-rabbit和抗體HRP-conjugated goat anti-mouse購(gòu)自Protech公司；HisTrap FF crude預(yù)裝柱購(gòu)自GE公司；SDS-PAGE Gel Kit和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 UK基因的合成與重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)ASFV Georgia 2007/1 株 UK基因序列（GenBank登錄號(hào)：FR682468.1）合成UK全基因，并連入pUC57-simple載體。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，UK-F：5'-CGGGATCCATGTCTACACATGATTGT TCTCT-3'，UK-R：5'-CCGCTCGAGATTATTCTT CTGGATGGAGCG-3'。上游引物含BamH I酶切位點(diǎn)、下游引物含Xho I酶切位點(diǎn)。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

以合成的pUC57-UK質(zhì)粒為模板，UK-F/UK-R為引物，進(jìn)行UK基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 25 μL、上下游引物各2 μL、DNA模板50 ng，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化目的片段。目的片段和pET-28a（+）空載體分別經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切，純化回收相應(yīng)目的片段，T4連接酶16℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，并涂布于相應(yīng)LB平板，37℃倒置培養(yǎng)。菌液PCR鑒定正確后，送至北京金唯智公司測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒按照小提質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，命名為pET-28aUK，-20℃保存。

1.4 DP96R蛋白的表達(dá)形式分析將原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-UK轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)OD600至0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG，分別在37℃培養(yǎng)5 h或在16℃培養(yǎng)10 h后，4℃、12 000×g離心10 min，收集菌體沉淀。沉淀經(jīng)PBS洗滌后，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎（功率28%，超聲3 s，間隔5 s，共破碎60次），12 000×g離心10 min后分別取上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 DP96R蛋白純化與Western blot鑒定將重組pET-28a-UK接種至2 L卡那抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)OD600至0.6；加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG，16℃誘導(dǎo)10 h；4℃、12 000×g離心10 min，收集菌體，以PBS洗滌沉淀后再次重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎至溶液澄清。收集上清液經(jīng)Ni親和層析預(yù)裝柱純化，首先用含30 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫雜質(zhì)蛋白，然后使用含500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE、Western blot分析，并進(jìn)行蛋白定量。

1.6 兔多抗血清的制備與鑒定將400 μg DP96R重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后，在新西蘭大白兔大腿內(nèi)側(cè)肌肉和背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行首免，同時(shí)對(duì)照組接種等量體積的PBS。首免后2周和4周，分別將DP96R蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻后進(jìn)行加強(qiáng)免疫并采集血清。三免后10 d心臟采血，收集血清。

采用方陣滴定法，將純化的DP96R蛋白進(jìn)行倍比稀釋后包被酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜；用PBST洗滌4次，每次2～3 min，以5%脫脂乳粉37℃封閉2 h；PBST洗滌，DP96R蛋白一免、二免、三免后獲得的抗血清用5%脫脂乳粉進(jìn)行倍比稀釋，分別加入對(duì)應(yīng)蛋白孔，37℃孵育1 h，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照；PBST洗滌，加入用5%脫脂乳粉稀釋的HRP標(biāo)記二抗（稀釋比為1∶4000），37℃孵育1 h；PBST洗滌，每孔加入50 μL TMB顯色液，避光顯色20 min后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)并檢測(cè)OD450值。

1.7 Wstern blot及間接免疫熒光檢測(cè)將pEGFP-N1-UK與pEGFP-N1空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞，用含1 mmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，離心取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC膜）。將NC膜用含5%脫脂乳粉的TBST溶液37℃封閉2 h，分別用含5%BSA的TBST溶液將EGFP標(biāo)簽單抗和抗DP96R蛋白多抗以1:4000稀釋后作為一抗，37℃作用1 h，洗滌，孵育相應(yīng)二抗，洗滌后進(jìn)行ECL發(fā)光顯色。

此外，將pEGFP-N1-UK和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染96孔293T細(xì)胞，24 h后使用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min；PBS洗滌3次后，每孔加入200 μL含0.3%Triton 100的1%BSA溶液封閉1 h；PBS洗滌后，將 DP96R蛋白多抗以1:1000稀釋后加入對(duì)應(yīng)細(xì)胞孔中，4℃過(guò)夜孵育；PBS洗滌后，添加相應(yīng)熒光二抗在37℃避光孵育1 h，洗滌后進(jìn)行DAPI染色，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 UK基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在250～500 bp之間可見(jiàn)單一擴(kuò)增條帶（圖1），條帶大小與預(yù)期相符（UK:291 bp）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，經(jīng)雙酶切后與載體質(zhì)粒pET-28a（+）連接并轉(zhuǎn)化DH5Hα，挑取菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定后測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確后將重組質(zhì)粒分別命名為pET-28a-UK、pEGFP-N1-UK。

圖1 ASFV UK基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplication of ASFV-UK gene

2.2 DP96R蛋白的表達(dá)形式分析SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí)，在16℃誘導(dǎo)10 h或37℃誘導(dǎo)5 h后，pET-28a-UK樣品中均出現(xiàn)1條明顯的蛋白條帶，大小約15 kDa，與預(yù)測(cè)的11 kDa相差較大。這種差異可能與串聯(lián)重復(fù)序列的存在而導(dǎo)致的異常凝膠遷移率有關(guān)，蛋白以可溶性表達(dá)為主，空載體pET-28a對(duì)照組及未誘導(dǎo)的pET-28a-UK菌液樣品中均未出現(xiàn)對(duì)應(yīng)條帶（圖2）。

圖2 DP96R蛋白 SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of DP96R protein

2.3 DP96R蛋白純化的SDS-PAGE分析及Western blot驗(yàn)證利用HisTrap FF crude預(yù)裝柱純化重組DP96R蛋白，SDS-PAGE和Western blot結(jié)果表明，純化后的DP96R蛋白條帶較為單一（圖3A、3B）。蛋白純度達(dá)到90%以上，BCA法定量蛋白濃度為600 μg/mL，滿足后期免疫要求。

圖3 純化重組蛋白DP96R的SDS-PAGE(A)及Western blot(B)鑒定Fig. 3 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) analysis of puri fied DP96R proteins

2.4 DP96R蛋白多克隆抗體的制備與鑒定利用純化的DP96R重組蛋白免疫新西蘭大白兔，分別在14、28、38 d采血，收集血清并進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，DP96R蛋白首次免疫后2周，抗體水平開(kāi)始上升，加強(qiáng)免疫后2周抗體水平有顯著提高，3次免疫后抗體維持在較高水平，而對(duì)照組3次免疫血清抗體檢測(cè)均為陰性（OD450＜0.10）。

圖4 抗DP96R蛋白多克隆抗體的制備與鑒定Fig. 4 Preparation and identi fication of anti-DP96R protein polyclonal antibodies

2.5 DP96R蛋白多克隆抗體特異性分析與鑒定為驗(yàn)證多克隆抗體的特異性，將pEGFP-N1-UK質(zhì)粒和pEGFP-N1空載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)（immunofluorescence assay，IFA）和Western blot分析。IFA結(jié)果顯示，DP96R蛋白多克隆抗體可特異性識(shí)別293T細(xì)胞中表達(dá)的DP96R蛋白，而與空白對(duì)照沒(méi)有反應(yīng)（圖5）。DP96R蛋白多抗與EGFP抗體均可識(shí)別蛋白分子量大小約為40 kDa的特異性蛋白條帶（圖6）。結(jié)果表明制備的抗DP96R蛋白的多克隆抗體具較好的反應(yīng)性和特異性。

圖5 DP96R蛋白免疫熒光檢測(cè)Fig. 5 Immuno fl uorescence assay analysis of DP96R protein

圖6 DP96R 蛋白的Western blot檢測(cè)Fig. 6 Western blot analysis of DP96R protein

3 討論

ASF為OIE法定報(bào)告的烈性傳染病之一，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)將其列為動(dòng)物一類傳染病，至今仍無(wú)有效的商品化疫苗問(wèn)世。現(xiàn)有ASF的防控方法主要包括流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、劃定疫區(qū)以及撲殺受感染動(dòng)物等[16-17]。目前，在ASF的疫苗研究中，缺失活病毒疫苗是研究的重點(diǎn)[18-20]。UK基因是ASFV的毒力基因之一，UK基因位于基因組右側(cè)毒力相關(guān)基因NL-S的上游。已有研究表明，UK基因?qū)SFV在體外巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖是非必需基因，但卻是影響病毒毒力和對(duì)家豬致病力的重要因素之一[14]。ASFV E70缺失UK基因，ASFV Georgia 2007毒株同時(shí)缺失9GL和UK基因后，病毒毒力均明顯下降，且免疫后能提供一定的保護(hù)力[15]。

對(duì)歐洲、非洲等來(lái)源的ASFV毒株UK基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)UK基因表達(dá)的DP96R蛋白氨基酸序列高度保守，遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)與UK基因具有顯著相似性的其他已知基因。ASFV Georgia 2007毒株中UK基因開(kāi)放閱讀框共有291 bp，表達(dá)96個(gè)氨基酸，其中包含4個(gè)連續(xù)重復(fù)序列，每個(gè)序列包含10個(gè)氨基酸（EKXXXXXXXX）[14]，這些串聯(lián)重復(fù)序列的存在導(dǎo)致異常凝膠遷移率，因此重組原核DP96R蛋白的分子量在15 kDa左右。

本研究針對(duì)ASFV Georgia 2007/1的UK基因，構(gòu)建了含有His標(biāo)簽的重組原核表達(dá)質(zhì)粒。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，低溫誘導(dǎo)時(shí)，DP96R蛋白主要呈可溶性表達(dá)，經(jīng)純化獲得純度＞90%的重組蛋白。Western blot和ELISA結(jié)果表明DP96R蛋白具有較好的反應(yīng)原性，制備的多抗可用于Western blot檢測(cè)和IFA檢測(cè)，為進(jìn)一步研究蛋白的生物學(xué)功能以及建立ASFV UK基因缺失毒株鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。