黃麗麗 吳玉璘 林寧 石慧 姜志欣 王麗娟 陳偉 封婕 査樹(shù)偉 許豪勤

分子生物學(xué)和人類(lèi)遺傳學(xué)研究的不斷進(jìn)展，推動(dòng)了耳聾基因芯片檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展完善[1]，可以通過(guò)識(shí)別特異性的耳聾基因，預(yù)防遺傳性聾缺陷小兒的出生，降低藥物性聾的風(fēng)險(xiǎn)，從而減少或者延緩遺傳性聾的發(fā)生發(fā)展。我國(guó)耳聾基因的流行病學(xué)調(diào)查顯示[2～4]，GJB2、SLC26A4、線(xiàn)粒體12SrRNA和GJB3基因突變是導(dǎo)致國(guó)人聽(tīng)力障礙的主要基因。優(yōu)生優(yōu)育、孕育健康的后代是每個(gè)家庭的愿望，做好孕前及孕早期的耳聾遺傳檢測(cè)對(duì)確保每個(gè)家庭生育聽(tīng)力健康的后代至關(guān)重要[5,6]。在孕前進(jìn)行微陣列耳聾基因芯片檢測(cè)，有助于了解檢測(cè)者本人及其家屬所攜帶的基因類(lèi)型，可以有效地減少遺傳性聾的出生缺陷[7]。本研究對(duì)江蘇省部分地區(qū)孕前人群進(jìn)行耳聾基因篩查及耳聾相關(guān)遺傳咨詢(xún)，旨在探討孕前人群耳聾基因篩查及相關(guān)遺傳咨詢(xún)的意義。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象及分組 以“國(guó)家免費(fèi)孕前優(yōu)生健康檢查項(xiàng)目”工作開(kāi)展早、基礎(chǔ)好、技術(shù)高為條件，在江蘇省的蘇北、蘇中、蘇南共抽取項(xiàng)目點(diǎn)6個(gè)，分別為漣水、沭陽(yáng)、如皋、泰興、鎮(zhèn)江及高郵，共收集孕前耳聾基因篩查人群1 843例，分成孕前耳聾高危組1 203例和孕前非耳聾高危組640例。孕前耳聾高危組納入標(biāo)準(zhǔn)：①已領(lǐng)取結(jié)婚證準(zhǔn)備生育且有聽(tīng)力障礙的殘疾人；②本人無(wú)聽(tīng)力障礙但直系親屬中有聽(tīng)力障礙的準(zhǔn)備生育夫婦；③已生育有聽(tīng)力障礙的小兒且符合再生育條件準(zhǔn)備生育的夫婦；④藥物性致聾患者的母系家族成員中有生育意愿的夫婦；⑤家庭直系親屬中有聽(tīng)力障礙未成年人；⑥有聽(tīng)力障礙的子女自愿參加檢查。條件許可或家庭研究需要時(shí)一些人群也需要參加耳聾基因篩查，如孕前檢查中的一般人群夫婦，正懷孕(孕前或產(chǎn)前)婦女的高風(fēng)險(xiǎn)(或一般)人群夫婦，新生兒等。孕前非耳聾高危組為排除以上孕前耳聾高危因素的孕前人群。孕前耳聾高危組中男599例(平均年齡25.5±13.5歲)，女604例(平均年齡26.7±12.5歲)；孕前非耳聾高危組中男288例(平均年齡29.1±5.6歲)，女352例(平均年齡27.4±4.5歲)。經(jīng)知情同意后進(jìn)行信息采集，內(nèi)容包括：基本信息、耳聾一般情況、個(gè)人患病史、體格檢查，以及耳聾基因芯片檢測(cè)等。

1.2研究方法

1.2.1外周靜脈血采集 集中采集兩組受試者靜脈血2～3 ml，EDTA抗凝，冷鏈集中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存，然后進(jìn)行DNA提取和微陣列芯片檢測(cè)。

1.2.2耳聾基因檢測(cè) 使用北京博奧生物公司的微陣列耳聾基因芯片，對(duì)GJB2、GJB3、SLC26A4、線(xiàn)粒體12SrRNA中的4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因中的9個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，包括：GJB2基因35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT，GJB3基因538 C>T，SLC26A4基因2168 A>G、IVS7-2 A>G和線(xiàn)粒體12S rRNA基因1494 C>T、1555 A>G。

1.2.3遺傳咨詢(xún) 對(duì)各項(xiàng)目點(diǎn)有臨床資質(zhì)(執(zhí)業(yè)醫(yī)師)的醫(yī)療技術(shù)服務(wù)人員進(jìn)行咨詢(xún)內(nèi)容的系統(tǒng)培訓(xùn)并考核。隨后組織各項(xiàng)目地區(qū)的篩查對(duì)象前往咨詢(xún)點(diǎn)進(jìn)行咨詢(xún)，并由咨詢(xún)?nèi)藛T填寫(xiě)咨詢(xún)表格。咨詢(xún)形式為面對(duì)面問(wèn)答，有疑問(wèn)則由項(xiàng)目組醫(yī)師進(jìn)一步解答，仍然無(wú)法解答的疑難病例由相關(guān)專(zhuān)家咨詢(xún)。咨詢(xún)表內(nèi)容分為三個(gè)部分(見(jiàn)附錄)，分別由項(xiàng)目點(diǎn)醫(yī)師、項(xiàng)目組醫(yī)師及外聯(lián)專(zhuān)家填寫(xiě)，做到常見(jiàn)問(wèn)題在基層咨詢(xún)、疑難問(wèn)題找專(zhuān)家解決。

2 結(jié)果

2.1耳聾基因篩查結(jié)果 1 843例的孕前人群中，耳聾基因突變檢出率為33.97%(626/1 843)，其中GJB2的耳聾基因突變率為16.87%(311/1 843)，GJB3耳聾基因突變率為0.16%(3/1 843)，SLC26A4耳聾基因突變率為9.06%(167/1 843)，線(xiàn)粒體12SrRNA耳聾基因突變率為7.87%(145/1 843)。檢出基因突變的626例中，GJB2的純合突變16.13%，單雜合突變占26.52%，復(fù)合雜合突變占7.03%；GJB3的單雜合突變占0.48%；SLC26A4的純合突變占3.67%，單雜合突變占16.62%，復(fù)合雜合突變占6.39%；線(xiàn)粒體12SrRNA突變占23.16%。1 843例耳聾基因的突變位點(diǎn)、類(lèi)型及突變率見(jiàn)表1。

2.2兩組耳聾基因突變檢出比較 1 203例孕前耳聾高危組中，GJB2的耳聾基因突變率為24.02%，GJB3耳聾基因突變率為0.08%，SLC26A4耳聾基因突變率為13.22%，線(xiàn)粒體12SrRNA耳聾基因突變率為11.89%。640例孕前非耳聾高危組中，GJB2的耳聾基因突變率為3.44%，GJB3耳聾基因突變率為0.31%，SLC26A4耳聾基因突變率為1.25%，線(xiàn)粒體12SrRNA耳聾基因突變率為0.31%。兩組不同耳聾基因突變的檢出率和例數(shù)分布見(jiàn)表2。

表1 1 843例孕前人群耳聾基因突變位點(diǎn)、類(lèi)型及突變率

表2 孕前耳聾高危組和非耳聾高危組不同耳聾基因突變的例數(shù)分布(例，%)

2.3耳聾相關(guān)遺傳問(wèn)題咨詢(xún) 共發(fā)放遺傳性聾基因芯片報(bào)告咨詢(xún)表1 843人份，最終回收949人份，經(jīng)統(tǒng)計(jì)共咨詢(xún)和解答問(wèn)題728個(gè)(例)，其中，基因遺傳問(wèn)題420例(57.69%)，生育風(fēng)險(xiǎn)222例(30.49%)，產(chǎn)前診斷25例(3.44%)，預(yù)防治療61例(8.38%)。

2.45個(gè)典型家庭的耳聾基因檢測(cè)結(jié)果及遺傳咨詢(xún) 5個(gè)家庭的微陣列耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

例1家庭咨詢(xún)兒子婚配后下一代發(fā)生耳聾的風(fēng)險(xiǎn)，告知其GJB2 235基因的隱性遺傳規(guī)律，兒子基因突變來(lái)自父親或母親，建議其婚配對(duì)象進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的檢測(cè)可以有效預(yù)防生育耳聾患者。

例2家庭咨詢(xún)下一代是否也為耳聾患者，告知其線(xiàn)粒體 DNA A1555G的母系遺傳規(guī)律，他們的后代為對(duì)耳毒性藥物敏感的線(xiàn)粒體基因A1555G的突變攜帶者，絕對(duì)禁止使用氨基糖苷類(lèi)抗生素。SLC26A4基因突變與大前庭水管綜合征和耳蝸畸形有非常密切的關(guān)系，建議丈夫進(jìn)行SLC基因的全基因測(cè)序，如果丈夫經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)是SLC的復(fù)合雜合突變，則其妻子需要進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的檢測(cè)，防止生育耳聾后代。

表3 5個(gè)孕前耳聾基因篩查家庭的微陣列耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果

例3家庭咨詢(xún)生育下一代發(fā)生耳聾的風(fēng)險(xiǎn)，告知該夫婦丈夫的耳聾很有可能是應(yīng)用了氨基糖苷類(lèi)藥物所致，而線(xiàn)粒體 DNA A1555G遵循母系遺傳規(guī)律，其線(xiàn)粒體 DNA A1555G突變基因不會(huì)遺傳給后代。同時(shí)建議丈夫行GJB2基因的全序列測(cè)序分析，排除其GJB2和GJB2上的其他位點(diǎn)的雙雜合突變引起的耳聾；若GJB2基因的全序列測(cè)序分析結(jié)果存在雙雜合突變，則該夫婦生育的后代100%為GJB2基因的攜帶者；若測(cè)序排除了雙雜合突變，那么他們生育GJB2基因的攜帶者的概率為50%，不會(huì)發(fā)生GJB2基因突變致聾。

例4家庭咨詢(xún)生育后代的聽(tīng)力情況，告知該對(duì)夫婦SLC26A4基因突變與大前庭水管綜合征和耳蝸畸形有非常密切的關(guān)系，建議妻子進(jìn)行顳骨CT檢查，判斷是否為大前庭水管綜合征，必要時(shí)需要進(jìn)行SLC26A4基因的全序列分析，建議丈夫進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的全序列檢測(cè)，防止生育耳聾后代。

例5家庭咨詢(xún)女兒的耳聾原因以及再生育后代發(fā)生耳聾的風(fēng)險(xiǎn)，告知其女兒的突變基因分別來(lái)自父親和母親，兩者的貢獻(xiàn)相同，如果該夫婦再生育，生育正常后代的概率為25%，50%的概率為GJB2 突變基因攜帶者，25%的概率為聾兒；因此，建議母親在專(zhuān)科醫(yī)生的指導(dǎo)下，選擇合適的檢測(cè)時(shí)機(jī)及檢測(cè)方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷，從而預(yù)防耳聾患兒的出生。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查研究[8，9]顯示，在我國(guó)正常人群中GJB2基因突變攜帶率為3.16%，SLC26A4基因突變攜帶率為2.75%，線(xiàn)粒體DNA基因突變攜帶率為2.87%，這也是我國(guó)遺傳性聾高發(fā)的基礎(chǔ)，這些致聾基因所致的遺傳性聾在國(guó)內(nèi)有著較高的發(fā)病率[10，11]。

GJB2是非綜合征型遺傳性聾最常見(jiàn)的突變基因，其所占比例甚至達(dá)50%[12，13]。本研究檢出耳聾基因突變的626例中，311例為GJB2基因突變(占49.68%)；GJB2基因的編碼產(chǎn)物跨膜蛋白Cx26在信息傳遞和物質(zhì)交換中發(fā)揮重要作用，它在耳蝸的血管紋、螺旋緣凸、基底細(xì)胞、神經(jīng)感覺(jué)上皮及耳蝸傳導(dǎo)纖維等處都有分布，是細(xì)胞間電解質(zhì)、第二信使和代謝物質(zhì)的重要通道[14]。在我國(guó)約有21%的先天性聾患者與GJB2基因突變相關(guān)[15]，如果雙方都是GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾患者，那么他們婚配后的下一代100%是聾兒；如果GJB2相關(guān)性耳聾者與非GJB2相關(guān)性耳聾者進(jìn)行婚配，那么生育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)性將大大降低；所以避免選擇相同的GJB2基因致聾的聾啞人婚配可以有效降低生育GJB2相關(guān)聾兒的風(fēng)險(xiǎn)。GJB2在正常人群中同樣具有較高的攜帶率，正如本研究中的例1和例5家庭；受檢者GJB2四個(gè)位點(diǎn)中僅有一個(gè)位點(diǎn)雜合突變者，遺傳咨詢(xún)時(shí)應(yīng)注意詳細(xì)了解受檢者的個(gè)人及家族的聽(tīng)力情況。因本研究耳聾基因芯片篩查僅包含4個(gè)基因的9個(gè)位點(diǎn)，沒(méi)有涵蓋相關(guān)基因的全部致聾突變，可能存在罕見(jiàn)或未知突變，故建議進(jìn)行GJB2的全序列分析；若受檢者是GJB2的純合突變或復(fù)合雜合突變，則需詳細(xì)了解該受檢者的聽(tīng)力和耳聾家族史，其父母再生育聾兒的風(fēng)險(xiǎn)為25%，可在孕前行胚胎植入前診斷或孕后行產(chǎn)前診斷，其配偶生育前應(yīng)進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)，預(yù)防耳聾后代的發(fā)生，同時(shí)該受檢者親屬攜帶GJB2突變的可能性較大，也建議婚育前行耳聾基因檢測(cè)。有資料顯示[16]，GJB2基因突變陽(yáng)性的耳聾患者其耳蝸神經(jīng)正常，人工耳蝸植入后聽(tīng)力康復(fù)效果較GJB2基因突變陰性者更好，因此對(duì)孕前人群GJB2基因進(jìn)行檢測(cè)不僅對(duì)遺傳性聾的臨床診斷和遺傳咨詢(xún)有重要幫助，還對(duì)聽(tīng)力康復(fù)措施的選擇有一定指導(dǎo)作用。

SLC26A4基因與大前庭水管綜合征密切相關(guān)，它也是Pendred的致病基因，所以又稱(chēng)之為PDS基因。臨床上約11%～15%的耳聾患者與SLC26A4基因突變有關(guān)，顳骨CT示前庭水管擴(kuò)大的耳聾患者應(yīng)進(jìn)行SLC26A4基因突變檢測(cè)，90%以上的此類(lèi)患者可找到明確的致病突變。SLC26A4基因突變是僅次于GJB2基因突變而引起常染色體隱性遺傳非綜合征型聾的致病因素，本研究檢出耳聾基因突變的626中，167例為SLC26A4基因突變，僅次于GJB2基因突變檢出率。SLC26A4基因突變會(huì)引起主要氨基酸發(fā)生置換，還發(fā)生剪接突變或移碼突變，改變了pendrin蛋白的合成與功能，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生障礙，最終陰離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能打破細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡引起耳聾[17]。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致大前庭水管綜合征，其特點(diǎn)是出生時(shí)大多聽(tīng)力正常，隨著外界環(huán)境的變化及誘因的刺激，聽(tīng)力呈波動(dòng)性下降，最終發(fā)展為耳聾。因此，攜帶該基因突變的患者，應(yīng)預(yù)防感冒等外界因素的刺激，盡量避免頭部外傷、禁止劇烈的體育活動(dòng)或倒立。SLC26A4基因突變類(lèi)型種類(lèi)多樣，可以是純合突變，也可以是復(fù)合雜合突變；SLC26A4基因同GJB2基因一樣，遵循常染色體隱性遺傳的規(guī)律；如果患兒耳聾基因檢測(cè)結(jié)果為SLC26A4純合突變，說(shuō)明患兒是SLC26A4基因突變導(dǎo)致的遺傳性聾，從理論上來(lái)講，其父母應(yīng)該為SLC26A4突變基因的攜帶者，他們?cè)偕@兒的風(fēng)險(xiǎn)為25%。若受檢者是SLC26A4單雜合突變者，例如：本研究中例4家庭妻子，則建議受檢者本人行顳骨CT檢查以確定其是否為大前庭水管綜合征，必要時(shí)行SLC26A4全序列分析，并建議其配偶行該基因位點(diǎn)的全序列檢測(cè)；同時(shí)，受檢者親屬攜帶此突變的可能性較大，也建議婚育前行耳聾基因檢測(cè)。

線(xiàn)粒體12SrRNA是導(dǎo)致氨基糖苷類(lèi)藥物性聾的重要基因，其中1494C>T和1555A>T是中國(guó)人群中常見(jiàn)的藥物性聾的相關(guān)突變位點(diǎn)，在人群中的攜帶率分別為0.45%和3.34%[18]。有研究表明[19]，1494C>T或1555A>T突變會(huì)在12SrRNA的A區(qū)形成一個(gè)新的結(jié)合堿基對(duì)，由此生成的12SrRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌的16SrRNA結(jié)構(gòu)非常相似，所以該基因突變的攜帶者對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素高度敏感，臨床上甚至出現(xiàn)“一針致聾”現(xiàn)象[20]。線(xiàn)粒體DNA都遵循母系遺傳方式，本研究中例2家庭的妻子為線(xiàn)粒體 12S rRNA 1555 A>G 均質(zhì)突變，所以遺傳咨詢(xún)時(shí)告知其后代為A1555G突變攜帶者，絕對(duì)禁止使用氨基糖苷類(lèi)抗生素，如果因特殊原因需要使用此類(lèi)藥物時(shí)，需要在醫(yī)師的指導(dǎo)下用藥，并密切監(jiān)測(cè)聽(tīng)力。而例3家庭中的丈夫含有線(xiàn)粒體 12S rRNA 1555 A>G 的突變基因，其后代不會(huì)含有線(xiàn)粒體 12S rRNA 1555 A>G 的突變基因，但要注意該夫婦的其他耳聾突變基因。

GJB3定位于人類(lèi)染色體1P33-35，編碼有270個(gè)氨基酸的連接蛋白Cx31,DNA 全長(zhǎng)3 617 bp。c.538C>T是GJB3的突變位點(diǎn)，然而該位點(diǎn)的致病性仍有爭(zhēng)議。王帥等[21]研究發(fā)現(xiàn)GJB3基因的c.538C>T點(diǎn)突變導(dǎo)致其編碼的Cx31蛋白的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，可能通過(guò)影響細(xì)胞間隙連接的形成，從而導(dǎo)致遺傳性聾。黃莎莎等[22]研究顯示GJB3 c.538C>T突變?cè)谥袊?guó)人群中檢出率較低，沒(méi)有足夠的證據(jù)顯示該位點(diǎn)與常染色體顯性非綜合征型聾有相關(guān)性；有研究[23]顯示，GJB3基因突變檢出率分別為0.56%(1/87)、0.75%(1/133)，本研究中GJB3基因突變檢出率0.16%，低于GJB2、SLC26A4及線(xiàn)粒體12SrRNA。若受檢者有GJB3基因c.538C>T位點(diǎn)雜合或純合突變，告知其c.538C>T突變與耳聾的關(guān)系尚不明確，建議其應(yīng)注意觀(guān)察聽(tīng)力的變化。

遺傳性聾的基因診斷和遺傳咨詢(xún)應(yīng)該是個(gè)體化的[24],有的家庭是為了確定耳聾的原因，有的是為了評(píng)估后代的患病風(fēng)險(xiǎn)，有的是為了尋找最佳治療方案。在進(jìn)行耳聾的遺傳咨詢(xún)時(shí)，要全面了解咨詢(xún)對(duì)象的情況，詳細(xì)詢(xún)問(wèn)醫(yī)療史、家族史、生育史等，繪制出正確的家系遺傳圖譜，按照遺傳病的類(lèi)型和遺傳方式對(duì)生育子代的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。在針對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行遺傳咨詢(xún)時(shí)，需要結(jié)合患者的聽(tīng)力表型和臨床診斷，對(duì)于有需要的特定人群建議去有資質(zhì)的醫(yī)院在專(zhuān)科醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行產(chǎn)前診斷。耳聾基因的遺傳具有高度異質(zhì)性，野生型并不代表受檢者沒(méi)有攜帶其他遺傳性聾相關(guān)基因突變的可能，對(duì)于野生型的基因芯片檢測(cè)結(jié)果，遺傳咨詢(xún)時(shí)也應(yīng)慎重對(duì)待[25]。對(duì)于常規(guī)耳聾基因篩查陰性的咨詢(xún)者應(yīng)告知受檢者只是不攜帶篩查范圍內(nèi)的中國(guó)人群最常見(jiàn)的耳聾基因突變，只能排除常見(jiàn)基因致聾突變的可能性。如果受檢者來(lái)進(jìn)行產(chǎn)前指導(dǎo)，應(yīng)告知耳聾基因篩查結(jié)果不等同于耳聾基因診斷，因未發(fā)現(xiàn)明確致病突變，也不能用于產(chǎn)前診斷。為減少出生缺陷的發(fā)生，WTO提出了三級(jí)預(yù)防的應(yīng)對(duì)策略，目前遺傳性聾的孕期產(chǎn)前診斷(二級(jí)預(yù)防)和新生兒的耳聾基因篩查(三級(jí)預(yù)防)研究較多，而孕前的耳聾基因篩查(一級(jí)預(yù)防)相對(duì)較少，如果能在孕前人群中開(kāi)展耳聾基因篩查，并提供健康教育和個(gè)體化的遺傳咨詢(xún)，那么就能實(shí)現(xiàn)遺傳性耳聾的一級(jí)預(yù)防，有效減少遺傳性耳聾小兒的出生，促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育。