韓藝，王文君，2，李慶華，李景恩，2，*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330045）

平臥菊三七（Gynura procumbens（Lour.）Merr.）為菊科三七屬多年生草本植物，又名平臥土三七、蛇接骨、續(xù)命草、神仙草，多生于林間、溪旁、坡地的沙質(zhì)土壤，在我國南方廣泛分布[1-2]。根和莖都是中草藥的上等原料，其味甘淡，藥性平和，食之具有疏通經(jīng)脈、止咳、消炎、消腫化淤、活血生肌之功效，內(nèi)含黃酮類[3-4]、綠原酸[5-6]、萜烯類[7]、多酚類[8]類等活性成分，具有良好的抗氧化[9]、抗炎[10]、抗菌[11-12]、降血糖[13-15]、降血脂[16]、保肝[17-18]等藥理活性。由此可見，作為一種新資源食品，平臥菊三七具有良好的開發(fā)前景。

課題組前期利用乙醇分級沉淀法對平臥菊三七粗多糖（Gynura procumbens polysaccharide，GPP）進(jìn)行初步純化，于不同乙醇濃度（20%，40%，60%，80%）分別得到 GPP-20、GPP-40、GPP-60和 GPP-80 4 個新組分，其中GPP-20較其他3個組分具有明顯的清除羥基自由基和超氧自由基的作用[19]。但因其溶于水后呈深褐色，不僅影響多糖外觀，還會對吸光度檢測造成一定的影響，不利于后續(xù)結(jié)構(gòu)鑒定和藥理活性等相關(guān)研究。針對以上問題，本試驗(yàn)擬采用雙氧水法對GPP-20進(jìn)行脫色研究，以期為平臥菊三七多糖的深入研究與開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平臥菊三七粗多糖：由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院天然產(chǎn)物與功能食品實(shí)驗(yàn)室自制。

葡萄糖：西隴化工股份有限公司；無水乙醇：西隴科學(xué)股份有限公司；30%雙氧水：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；濃硫酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

V-5600型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；BDC-555WKM型電冰箱：合肥美的榮事達(dá)電冰箱有限公司；FA1004型電子天平：上海力辰有限公司；DZF-6090Z型真空干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；XH-C型旋渦混合器：金壇市白塔新寶儀器廠；TGL-16GB型高速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-60型數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷洌簢A電器有限公司；CT-6022型手持式pH計(jì)：柯迪達(dá)公司。

1.2 方法

1.2.1 GPP-20多糖的制備

稱取一定量的平臥菊三七粗多糖完全溶解于蒸餾水中，緩慢加入無水乙醇進(jìn)行攪拌。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到20%（體積分?jǐn)?shù)），于4℃冰箱中靜置12 h后離心（4 800 r/min，10 min）。將所得沉淀復(fù)溶于水，透析除去乙醇，然后進(jìn)行冷凍干燥，即得GPP-20組分。

1.2.2 脫色率的計(jì)算

精密稱取10 mg GPP-20多糖置于10 mL容量瓶中加蒸餾水定容，配制成濃度為1 mg/mL的稀溶液，在可見光區(qū)（400 nm～760 nm）進(jìn)行最大吸收波長掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 波長掃描試驗(yàn)Fig.1 Wavelenth scanning experiment

由圖1可見，GPP-20溶液在可見光區(qū)無最大吸收峰，又因試驗(yàn)濃度下多糖溶液呈淡黃色，因此從溶液互補(bǔ)色角度考慮，選取450 nm作為脫色率的檢測波長，并按公式（1）計(jì)算脫色率。

1.2.3 多糖保留率的計(jì)算

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱量100 mg葡萄糖對照品，定容于100 mL容量瓶，配制成1 mg/mL的母液；再取10 mL母液定容于100 mL容量瓶，配制成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液；然后將其稀釋成濃度為 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的工作溶液，分別置于6只試管內(nèi)。每只試管先后加入0.5 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，振蕩混勻后室溫靜置30 min[20]。用蒸餾水代替多糖液作為空白對照組，于490 nm波長下測定其吸光度，最后以葡萄糖濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.2.3.2 樣品含量的測定

分別將脫色前和脫色后的GPP-20溶液（1 mg/mL）稀釋10倍，按照“1.2.3.1”中苯酚-硫酸法測定樣品吸光度，然后通過回歸方程計(jì)算樣品中葡萄糖濃度，根據(jù)公式（2）（3）計(jì)算多糖含量及保留率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

稱取500mgGPP-20多糖，加蒸餾水配制成1mg/mL的溶液，用于單因素試驗(yàn)，分別考察雙氧水加入量、脫色溫度、脫色時間、pH值對脫色效果（脫色率和多糖保留率）的影響。為避免苯酚被氧化，顯色前必須將反應(yīng)液中過量的過氧化氫，以二氧化錳作為催化劑快速分解去除。直至試管中無明顯氣泡產(chǎn)生，表示過氧化氫基本分解完全，離心除去二氧化錳，取上清液待測。

1.2.4.1 雙氧水加入量對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入6根試管內(nèi)，pH值保持不變，加入不同體積的雙氧水，使其終濃度分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%，然后于50℃恒溫水浴4 h，取出放置室溫后，分別計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1.2.4.2 脫色溫度對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入6根試管內(nèi)，加入一定量雙氧水，使其體積分?jǐn)?shù)為9%，調(diào)節(jié)溶液 pH 值為 8，分別在 30、40、50、60、70、80 ℃的溫度下恒溫水浴4 h，分別計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1.2.4.3 反應(yīng)時間對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入6根試管內(nèi)，加入一定量雙氧水，使其體積分?jǐn)?shù)為9%，調(diào)節(jié)溶液 pH 值為 8，于 50℃恒溫水浴中分別反應(yīng) 1、2、3、4、5、6 h，然后取出計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1.2.4.4 pH值對多糖脫色效果的影響

各取GPP-20多糖溶液5 mL分別加入7根試管內(nèi)，加入一定量雙氧水，使其體積分?jǐn)?shù)為9%，調(diào)節(jié)溶液 pH 值分別為 4、5、6、7、8、9、10，50 ℃恒溫水浴 4 h，分別計(jì)算脫色率和多糖保留率。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對雙氧水加入量（A）、脫色溫度（B）、脫色時間（C）和pH值（D）進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，各因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用綜合加權(quán)評分法，多糖脫色率（X）和多糖保留率（Y）的權(quán)重系數(shù)均為0.5，則綜合評分Z=0.5（X+Y）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取5份1 mg/mL的GPP-20多糖溶液，按照正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳脫色條件進(jìn)行反應(yīng)，計(jì)算脫色率及多糖保留率，驗(yàn)證其是否為最佳脫色條件。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，字母標(biāo)注法表示數(shù)據(jù)間的差異關(guān)系。無相同字母表示差異顯著，有一個相同字母表示差異不顯著，其中小寫字母表示顯著水平α=0.05，大寫字母表示顯著水平α=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.3.1方法制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of glucose

如圖2所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，葡萄糖（0～0.1 mg/mL）與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.007 1C+0.027 4，其中A為吸光度，C為葡萄糖濃度，線性系數(shù)R2=0.996。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 雙氧水加入量對多糖脫色效果的影響

不同雙氧水加入量對脫色率及多糖保留率的影響見圖3。

圖3 雙氧水加入量對多糖脫色率及保留率的影響Fig.3 Effect of addition amount of H2O2on the decolorization rate and retention rate of polysaccharides

由圖3可見，隨雙氧水加入量的增加，脫色率逐漸升高，而多糖保留率逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析和多重比較發(fā)現(xiàn)，雙氧水加入量為9%～15%范圍內(nèi)，多糖保留率無顯著降低（p＜0.05）；但當(dāng)雙氧水加入量為18%時，保留率極顯著下降（p＜0.01），此時脫色率較之前并未明顯增大（p＜0.01），因此為避免多糖損失過多，選取雙氧水加入量為9%、12%、15%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 脫色溫度對多糖脫色效果的影響

不同反應(yīng)溫度對脫色率及多糖保留率的影響見圖4。

圖4 脫色溫度對多糖脫色率及保留率的影響Fig.4 Effect of decolorization temperature on the decolorization rate and retention rate of polysaccharides

由圖4可見，隨溫度的升高，多糖脫色率逐漸增高，保留率逐漸降低。方差分析結(jié)果顯示，在60℃～70℃附近，二者變化均趨于穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高為80℃，多糖脫色率顯著升高（p＜0.01），保留率顯著降低（p＜0.01），由52.26%（70℃）降至 44.92%（80℃），糖保留率過低，因此選取50、60、70℃3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 脫色時間對多糖脫色效果的影響

不同反應(yīng)時間對脫色率及多糖保留率的影響見圖5。

圖5可見，隨脫色時間的增加，脫色率逐漸增高，當(dāng)脫色時間由5 h延長至6 h時，脫色率并無顯著性升高（p＜0.05）；多糖保留率在1 h～4 h內(nèi)顯著下降（p＜0.01），4 h后基本趨于穩(wěn)定。從節(jié)約時間，提高效率的角度出發(fā)，選取脫色時間3、4、5 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 pH值對多糖脫色效果的影響

不同pH值對脫色率及多糖保留率的影響見圖6。

圖6 pH值對多糖脫色率及保留率的影響Fig.6 Effect of pH value on the decolorization rate and retention rate of polysaccharides

由圖6可見，隨著溶液pH值的升高，多糖脫色率逐漸增大，說明堿性條件有利于脫色，而多糖保留率在pH＜6或pH＞9的條件下均處于較低水平。當(dāng)pH＞9時，雖然脫色率極顯著上升（p＜0.01），但多糖保留率由78.45%降至 71.20%，發(fā)生顯著性下降（p＜0.01），綜合考慮后選取pH值7、8、9進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and intuitive analysis results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

根據(jù)表2和表3可以看出，各因素對多糖脫色效果的影響順序?yàn)闇囟龋˙）＞pH（D）＞雙氧水加入量（A）＞時間（C）。FB=16.19＞F0.01（2，8）=8.65，說明溫度影響極顯著；FD=11.59＞F0.01（2，8）=8.65，說明pH值影響極顯著；F0.05（2，8）=4.46＜FA=7.85＜F0.01（2，8）=8.65，雙氧水加入量影響顯著；FC=0.76 ＜ F0.05（2，8）=4.46，時間對試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。通過正交試驗(yàn)最終確定最優(yōu)工藝為A3B3C2D3，即溫度為70℃，雙氧水體積分?jǐn)?shù)為15%，調(diào)節(jié)pH值為9的條件下脫色4 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在A3B3C2D3最佳工藝條件下進(jìn)行5組驗(yàn)證試驗(yàn)（表4），結(jié)果顯示平均脫色率為（88.00±0.45）%，多糖平均保留率為（71.32±0.67）%，綜合評分為79.66±0.32，高于正交試驗(yàn)綜合評分中所有組別，因此確定該條件為平臥菊三七多糖GPP-20雙氧水脫色法的最佳工藝。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 4 The verification experiment result（n=5）

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)，分別考察雙氧水加入量、脫色溫度、脫色時間、pH值4個主要因素對平臥菊三七多糖GPP-20脫色效果的影響，并進(jìn)一步采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化其最佳脫色工藝。結(jié)果表明在溫度為70℃，雙氧水體積分?jǐn)?shù)15%，pH值為9的條件下脫色4 h，GPP-20的脫色效果較好，綜合評分達(dá)到（79.66±0.32）。

與活性炭和大孔樹脂法相比，雙氧水氧化法具有操作簡單、成本低、容易清除等優(yōu)點(diǎn)[21]，因此天然多糖脫除色素經(jīng)常采用后者[22-23]。然而試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶液中殘留的雙氧水會對苯酚-硫酸法造成不良影響，使反應(yīng)液顏色呈現(xiàn)綠色而無法繼續(xù)在490 nm處測定糖含量（正常為橙色），因此脫色反應(yīng)結(jié)束時必須首先除去雙氧水，再進(jìn)行顯色反應(yīng)。本試驗(yàn)選取二氧化錳固體催化劑，既能迅速分解雙氧水又能簡單去除。至于雙氧水對多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響及機(jī)理，則需要進(jìn)一步探索研究。