郭燕軍

(河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061001)

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，而舌部血供豐富、運動頻繁，導(dǎo)致舌鱗狀細(xì)胞癌生長快，浸潤性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移率高[1]。目前，臨床上主要采用傳統(tǒng)手術(shù)結(jié)合放化療的綜合方案治療，但化療耐藥性的產(chǎn)生往往導(dǎo)致療效不理想甚至復(fù)發(fā)[2]。因此高效低毒化療增敏劑是當(dāng)前抗舌鱗狀細(xì)胞癌藥物研發(fā)的熱點。大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，其對卵巢癌、宮頸癌、胃癌等均具有一定的抑制作用[3-5]，還能夠增強(qiáng)大腸癌HCT-8細(xì)胞對奧沙利鉑化療敏感性[6]和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對環(huán)磷酰胺化療敏感性[7]。順鉑為舌鱗狀細(xì)胞癌的一線化療用藥，但大蒜素能否增強(qiáng)順鉑化療敏感性、提高其療效尚不明確。本研究通過體外培養(yǎng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞并給予大蒜素+順鉑聯(lián)合干預(yù)，觀察了大蒜素對舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對順鉑化療的增敏作用，并初步探討了其機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1實驗細(xì)胞、藥物與試劑 人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室惠贈。大蒜素注射液購自黑龍江迪龍制藥有限公司(規(guī)格：2 mL∶30 mg)；注射用順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司(規(guī)格：6 mL∶30 mg)；MTT、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3多克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞分組與培養(yǎng) 人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株經(jīng)解凍復(fù)蘇后常規(guī)體外培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗?？瞻讓φ战M正常培養(yǎng)，大蒜素組和順鉑組分別加入25 μg/mL大蒜素和40 μg/mL順鉑進(jìn)行培養(yǎng)，聯(lián)合組加入25 μg/mL大蒜素和20 μg/mL順鉑進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)12個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2細(xì)胞生長抑制率測定 采用MTT法測定：各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為5×104mL-1后接種于96孔板(n=12)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔滴加20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，滴加150 μL DMSO，避光震蕩孵育10 min后通過酶標(biāo)儀測定波長490 nm處的吸光度(A)值，細(xì)胞生長抑制率(%)=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%。

1.2.3細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測：各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化和PBS溶液洗滌2次后，制備濃度約1×105的單細(xì)胞混懸液，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)混勻，避光孵育30 min后，分別加入400 μL緩沖液并混勻后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法檢測：經(jīng)胰酶消化并離心取細(xì)胞后，加入適量冷裂解液后置冰上30 min后超聲震碎10 s后，離心(13 000 r/min，4 ℃，20 min)取蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量和高溫變性后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、麗春紅溶液染色后經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3、β-actin 4 ℃孵育過夜，PBS洗膜3次，二抗(1∶100)室溫孵育1 h后顯色，然后根據(jù)條帶灰度值半定量分析Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞增殖抑制率 空白對照組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖抑制率為0，大蒜素組為(24.8±3.9)%，順鉑組為(32.7±5.3)%，聯(lián)合組為(49.7±6.8)%。大蒜素組、順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組(P均<0.05)，且聯(lián)合組顯著高于順鉑組和大蒜素組(P均<0.05)，順鉑組顯著高于大蒜素組(P<0.05)。

2.2細(xì)胞周期 大蒜素組、順鉑組和聯(lián)合組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞周期G2/M期比例顯著高于空白對照組(P均<0.05)，順鉑組和聯(lián)合組Tca8113細(xì)胞周期S期比例顯著低于空白對照組(P均<0.05)；聯(lián)合組Tca8113細(xì)胞周期S期比例顯著低于大蒜素組和順鉑組(P均<0.05)，G2/M期比例顯著高于大蒜素組和順鉑組(P均<0.05)，大蒜素組和順鉑組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞周期比較

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與聯(lián)合組比較，P<0.05。

2.3細(xì)胞凋亡情況 大蒜素組、順鉑組和聯(lián)合組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多，以聯(lián)合組最為顯著，見圖1。計算細(xì)胞凋亡率：空白對照組為(3.1±1.3)%，大蒜素組為(26.9±3.7)%，順鉑組為(44.2±5.8)%，聯(lián)合組為(60.5±7.1)%。大蒜素組、順鉑組和聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組(P均<0.05)，且聯(lián)合組顯著高于大蒜素組和順鉑組(P均<0.05)，順鉑組顯著高于大蒜素組(P<0.05)。

2.4Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)情況大蒜素組、順鉑組和聯(lián)合組Bax蛋白和激活型Caspase-3蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2比值均顯著高于空白對照組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著高于大蒜素組和順鉑組(P均<0.05)；大蒜素組、順鉑組和聯(lián)合組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著低于空白對照組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于大蒜素組和順鉑組(P均<0.05)。見圖2和表2。

圖1 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞凋亡情況

圖2 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表達(dá)情況

組別BaxBcl-2Bax/Bcl-2激活型Caspase-3空白對照組0.18±0.060.59±0.170.31±0.120.09±0.04大蒜素組0.24±0.09①②0.48±0.13①②2.08±0.79①②0.24±0.08①②順鉑組0.37±0.11①②0.45±0.12①②3.26±1.35①②0.37±0.11①②聯(lián)合組0.50±0.14①0.21±0.07①4.55±1.68①0.51±0.13①

注：①與空白對照組比較，P<0.05；②與聯(lián)合組比較，P<0.05。

3 討 論

口腔頜面部腫瘤占全身惡性腫瘤的10%左右，其中口腔鱗癌最為多見。舌鱗狀細(xì)胞癌占口腔癌的40%左右，且具有生長快、浸潤性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差的特點，嚴(yán)重危害著人類的生命健康[8]。目前該病主要采用手術(shù)結(jié)合術(shù)前術(shù)后化療方案治療，預(yù)后較差，化療耐藥性的產(chǎn)生是療效降低和復(fù)發(fā)的主要原因。因此研究高效、低毒的化療增敏新型藥物或許是提高抗腫瘤療效、延緩復(fù)發(fā)的有效途徑。

既往研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、阻滯細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞增殖等抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、胃癌MKN-45細(xì)胞生長，且具有時間和劑量依賴性[9-11]。此外，大蒜素的化療增敏作用也逐漸得到醫(yī)藥研究工作者的關(guān)注。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與單用順鉑組比較，聯(lián)合組能夠更加顯著地將人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞有絲分裂，顯著提高Tca8113細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率，提示大蒜素能夠增強(qiáng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞對順鉑化療敏感性。

細(xì)胞凋亡是一種多基因調(diào)控的程序性死亡過程，其中激活型Caspase參與細(xì)胞凋亡的啟動及整個過程的調(diào)節(jié)[12]。Bcl-2基因家族中的Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C釋放和Caspase-3激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]；而Bax具有破壞線粒體滲透性、激活Caspase-3而表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用[14]；Saeedi Borujeni等[15]研究發(fā)現(xiàn)Bax與Bcl-2能夠聚合成二聚體，從而相互抑制活性，所以Bax/Bcl-2比值更能夠體現(xiàn)二者對細(xì)胞凋亡的實際調(diào)控作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與單用順鉑組比較，聯(lián)合組能夠更有效上調(diào)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bax蛋白和激活型Caspase-3蛋白表達(dá)、下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)并提高Bax/bcl-2值；而與空白對照組比較，大蒜素干預(yù)能夠有效下調(diào)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bax/Bcl-2值，上調(diào)Bax蛋白和激活型Caspase-3蛋白表達(dá)，這可能是大蒜素增強(qiáng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞對順鉑化療敏感性的重要分子機(jī)制。

綜上所述，大蒜素可增強(qiáng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞對順鉑化療敏感性，可能與大蒜素抑制Tca8113細(xì)胞有絲分裂以及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3)表達(dá)有關(guān)。