(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092 1 附屬新華醫(yī)院兒心血管科； 2 附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心臟中心)

臨床一些復(fù)雜性先天性心臟病，如三尖瓣閉鎖、單心室、肺動脈閉鎖伴室間隔完整等病兒多數(shù)需行Fontan手術(shù)以降低死亡率。Fontan手術(shù)是將上、下腔靜脈直接連接到肺動脈，從而使肺循環(huán)和體循環(huán)分開，該手術(shù)雖然一定程度能夠減輕病兒低氧狀況，但術(shù)后一些常見并發(fā)癥，如心律失常、血栓栓塞、腔靜脈壓力升高及心力衰竭等可能會致病兒死亡[1]。由于腔靜脈血直接回流肺動脈，使肺動脈缺少“脈沖性”血流灌注，可造成術(shù)后肺動脈狹窄、扭曲，肺血栓和肺動脈高壓形成，且隨生存時間延長而日益明顯。多項臨床研究表明，F(xiàn)ontan術(shù)后血栓栓塞是造成病人死亡的重要原因。Fontan術(shù)后血栓形成常見原因有血管內(nèi)皮受損、血管狹窄、凝血功能異常等。臨床研究發(fā)現(xiàn)一些微小核糖核酸(miRNA)與血管內(nèi)皮損傷和血小板活化、血栓形成等有關(guān)。血管內(nèi)皮損傷以后miR-126以及miR-21常升高，而miR-96、miR-340以及miR-223升高則提示血小板活化[2]。本研究主要探討外周血白細胞、血小板以及血清中miRNA變化能否準確預(yù)測單心室病兒行Fontan術(shù)后對血小板活化以及血栓形成的影響，旨在為臨床隨訪及抗血栓治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

單心室行Fontan術(shù)后病兒6例(TG組)，男4例，女2例；年齡2～11歲，平均5.6歲；術(shù)后時間為1～5年。體檢正常的兒童6例(CG組)，男3例，女3例；年齡2～12歲，平均6.2歲。試驗前收集血液標本均告知家長并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，Waltham，美國)；倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，日本)；電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD，Irvine，美國)；Real-time檢測儀(天龍，TL988)。Ficoll(GE，17-5442-02,美國)；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit等試劑盒(Takara，日本)；Ikkb Antibody等抗體(Affinity，AF6009，美國)；RIPA組織細胞快速裂解液(Solarbio，R0010)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermos，PICPI23223，美國)等。

1.3 實驗方法

1.3.1血清、血小板和白細胞中miRNA提取 采集病兒靜脈血15 mL,分別用于血清、血小板和白細胞中miRNA提取。①血清miRNA提?。簩⑵渲械? mL靜脈血置于干管中，30 min內(nèi)高速離心(3 000 r/min離心10 min，后8 000 r/min離心15 min)分離血清。加入QIAzol試劑使血清變性，然后用Qiagen miRNeasy Mini Kit進行RNA采集和純化。②血小板miRNA提?。簩⑵渲? mL靜脈血置于抗凝管中，4 ℃靜止過夜收集上清液。采用DEPC水稀釋血清，然后12 000 r/min低溫離心10 min，收集血小板，用于提取miRNA。③白細胞miRNA提?。簩⑵渲? mL靜脈血以淋巴分離液Ficoll分離出單個核細胞，用于提取miRNA。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測不同標本中miRNA的表達 常規(guī)配置反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。各引物如下：內(nèi)參照U6正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′；miR-223正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-CCAGTCTCAG-GGTCCGAGGTATTC-3′；miR-150正義鏈：5′-TG-CGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-TGCG-GCTCTCCCAACCCTTGTA-3′；miR-126正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-TGCGGCCATTATTACTTTT-3′；miR-21正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈5′-TGCGGCTAGCTTATCAGACT-3′；miR-197正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-TGCGGCTTCACCACCTTCTCCA-3′。點好樣的PCR板放置于Real time PCR儀上進行PCR反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共進行40個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后進行熔解曲線分析，通過檢測Ct值，定量分析樣本中miRNA的表達量。

1.3.3流式細胞儀檢測外周血血小板活化水平以抗凝管采集CG和TG組兒童外周靜脈血5 mL，室溫下1 000 r/min離心10 min，上層淡黃色液體即為富血小板血漿(PRP)。緩慢吸出PRP置于新的離心管中，繼續(xù)室溫下4 000 r/min離心10 min后棄去上清液，所剩的部分為血小板沉淀。用含有1 g/L BSA和0.01 mol/L EDTA的PBS(0.01 mol/L)1 mL沖洗血小板沉淀，室溫下離心4 000 r/min離心10 min后再次棄去上清，重復(fù)3次，以此提純血小板沉淀。提純的血小板加入PBS 190 μL，混勻后均分成兩份，分別加入5 μL CD41a-PE抗體和5 μL CD62p-PE抗體，渦旋混勻；4 ℃孵育30 min；加入10倍體積的PBS，洗滌2次，流式細胞儀分選收集CD41a、CD62p陽性的細胞。

1.3.4Western Blot檢測白細胞內(nèi)抑制miR-223表達對Iκb和p-p65及NF-κB蛋白的影響 采集TG組和CG組抗凝外周血，將插入miR-223轉(zhuǎn)錄抑制因子的慢病毒轉(zhuǎn)染各組的外周血白細胞，分為CG+病毒無轉(zhuǎn)錄抑制因子組(CC組)，TG+病毒無轉(zhuǎn)錄抑制因子組(TC組)，CG+病毒含轉(zhuǎn)錄抑制因子組(CI組)和TG+病毒含轉(zhuǎn)錄抑制因子組(TI組)。觀察當miR-223表達抑制后，對白細胞NF-κB信號路徑中IKKb、Iκb以及NF-κB表達的影響。步驟如下。①蛋白收集：經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清液；PBS洗滌；加入RIPA裂解液裂解，離心后取上清液；②Western Blot檢測：將含有蛋白質(zhì)樣品加入緩沖液，進行垂直平板凝膠電泳，在電泳結(jié)束前，鋪PVCF膜，放入電轉(zhuǎn)儀中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，轉(zhuǎn)膜1 h；取膜以后以10 g/L的BSA室溫封閉2 h；然后分別加入TBST稀釋的一抗IKKb(1∶2 000)、Iκb(1∶2 000)、NF-κB(1∶3 000)、p-p65(1∶2 000)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h；加入化學(xué)發(fā)光試劑，至出現(xiàn)顯影條帶，取出包好PVDF膜，于暗室中用X膠片感光、顯影、定影，然后用圖像顯影儀進行分析，測平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組miRNA表達比較

兩組miR-126、miR-223表達水平比較，差異有顯著性(t=3.22、3.45，P<0.05)。見表1。

表1 兩組病人血清中miRNA表達水平比較(n=6,±s)

表1 兩組病人血清中miRNA表達水平比較(n=6,±s)

分組miR21miR126miR150miR197miR223CG組1.183±0.6181.055±0.3301.107±0.5301.097±0.4371.028±0.245TG組2.028±1.0640.507±0.2560.718±0.4060.727±0.2921.718±0.424

2.2 兩組血小板活化情況比較

實驗結(jié)果顯示，CG組CD62p、CD41a表達率分別為(4.6±1.2)%、(2.6±0.3)%，而TG組血小板中CD62p、CD41a的表達率分別為(12.3±1.8)%、(18.4±2.5)%，兩組比較，差異有顯著性(t=17.57、87.54，P<0.01)。

2.3 qRT-PCR檢測外周血血小板和白細胞中miR-223表達水平

以CG組外周血血小板或白細胞中miR-223相對表達水平為1，TG組外周血血小板中miR-223表達水平為6.2±0.52，而外周血白細胞中miR-223表達水平為5.4±0.56，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.62、4.32，P<0.05)。

2.4 含miR-223抑制因子的慢病毒轉(zhuǎn)染正常人白細胞對miR-223表達的影響

以CC組白細胞中miR-223相對表達水平為1，CI組白細胞中miR-223表達水平為0.36±0.04，兩組比較，差異有顯著性(t=45.30，P<0.01)。

2.5 白細胞內(nèi)miR-223表達抑制后對Iκb和p-p65及NF-κB表達的影響

與CC組比較，TC組白細胞中Iκb蛋白表達下調(diào)，p-p65蛋白表達上調(diào)，CI組白細胞中Iκb蛋白表達上調(diào)，p-p65蛋白表達下調(diào)；與CI組比較，TI組白細胞中Iκb蛋白表達下調(diào)，p-p65蛋白表達上調(diào)。Ikkb和NF-κB蛋白表達在不同處理組間無明顯變化。見圖1。

①CC組；②TC組；③CI組；④TI組。

3 討 論

Fontan術(shù)后血栓栓塞是病兒重要的死亡原因之一，主要和血管內(nèi)皮受損、血管平滑肌增生和血小板活化等有關(guān)[3-5]。由于部分血栓栓塞無明顯臨床癥狀，故其真實發(fā)生率難以估計[6-7]。MONAGLE等[8]分析了多中心資料估測發(fā)生率為3%～16%，KHAIRY等[9]分析波士頓兒童醫(yī)院261例病例發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ontan術(shù)后因血栓導(dǎo)致的死亡10年時為1%～3%，25年時則高達9%～12%。并發(fā)現(xiàn)術(shù)后未應(yīng)用抗凝或抗血小板治療是血栓栓塞性死亡的獨立危險因素。

最近研究顯示，miRNA可作為血管損傷的標志物，miRNA是高度保守的短鏈核糖核酸，廣泛參與調(diào)控基因表達[10-11]，其中miR-126、miR-21、miR-663與血管內(nèi)皮損傷有關(guān)[12-13]；miR-153、miR-145/143、miR-223等可反映血管內(nèi)皮增生的情況[14-15]，在血管狹窄的過程中胰島素樣生長因子1受體(ILGF1R)使血管平滑肌細胞增生，此時miR-223以及miR-153表達下調(diào)[16]。LAFFONT等[17]發(fā)現(xiàn)miR-223在血小板活化過程中高表達，可以作為凝血因子激活的指標。

本研究結(jié)果顯示，TG組病兒血清中miR-223表達水平較CG組明顯升高，當其升高時，血小板活化率也同時增強。血小板活化后，可釋放一些凝血因子如ADP、血栓素等，可促進血栓的形成[18]。此外，血小板中還含有豐富的miRNA[19]，進一步研究發(fā)現(xiàn)TG組病兒血小板和白細胞中miR-223表達增多，此時白細胞中NF-κB信號途徑中的Iκb蛋白表達下調(diào)，p-p65蛋白表達上調(diào)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制白細胞中miR-223的表達，CI組表現(xiàn)為Iκb蛋白表達上調(diào)，p-p65蛋白表達下調(diào)，但TI組與之相比，表現(xiàn)為Iκb蛋白表達下調(diào)，p-p65蛋白表達上調(diào)，說明白細胞中miR-223抑制后Iκb蛋白表達上調(diào)，p-p65蛋白表達下調(diào)。因此推測單心室行Fontan術(shù)后病兒白細胞中miR-223高于正常人，可造成Iκb蛋白表達水平降低而p-p65蛋白表達水平升高，繼而激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致進一步病理生理改變。

NF-κB蛋白家族是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子，可以與多種基因啟動子部位的κb位點發(fā)生特異性結(jié)合從而促進其轉(zhuǎn)錄表達。NF-κB為p50/p65異源二聚體，Iκbα和Iκbβ主要與含有p65和Rel的二聚體具有高親和力，是體內(nèi)NF-κB(p50-p65)的主要調(diào)控抑制蛋白。當細胞受到各種內(nèi)外刺激后，Iκb激酶被激活，從而導(dǎo)致Iκb蛋白磷酸化、泛素化，然后Iκb蛋白被降解，使NF-κB二聚體得到釋放。釋放后的NF-κB二聚體通過各種翻譯后的修飾作用而被進一步激活，并轉(zhuǎn)移到細胞核中。在細胞核里與目的基因結(jié)合，促進目的基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。Fontan術(shù)后病兒外周血白細胞中Iκb降低，使白細胞內(nèi)NF-κB活化，其活化后通過ICAM-1、VCAM-1與白細胞表面的配體相應(yīng)地結(jié)合，介導(dǎo)白細胞貼壁黏附、聚集、浸潤，導(dǎo)致局部炎癥發(fā)生，從而使微血管內(nèi)皮細胞損傷[22-23]。此外，NF-κB活化可促進血管性血友病因子(vWF)的表達。vWF是Ⅷ因子的相關(guān)因子，與Ⅷ因子結(jié)合，能有效防止Ⅷ因子在血漿中迅速降解。vWF與Ⅷ因子結(jié)合，組成FⅧ/vWF，一端與血小板糖蛋白Ib結(jié)合，另一端與內(nèi)皮細胞下的膠原纖維連接，介導(dǎo)血小板黏附血管內(nèi)皮，促進微血栓形成[24-25]。本實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)ontan術(shù)后血流動力學(xué)改變可能激活I(lǐng)κb激酶，從而使Iκb蛋白被降解，繼發(fā)引起NF-κB活化，造成血管內(nèi)皮損傷和微血栓形成，這可能是Fontan術(shù)后血栓形成較重要的原因。

但NF-κB活化后，如何調(diào)節(jié)細胞核基因的轉(zhuǎn)錄并對血栓形成造成影響，其具體機制本研究未涉及，未來尚需進一步深入研究探討。