鄭戈文

（山西省農(nóng)業(yè)種子總站，太原 030006）

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基本資料，種子質(zhì)量的優(yōu)劣關(guān)系到國(guó)計(jì)民生，種子質(zhì)量檢測(cè)是把好種子質(zhì)量關(guān)的重要手段。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，電泳技術(shù)在種子質(zhì)量檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。電泳是指在電場(chǎng)作用下，帶電顆粒向與其電性相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)是利用帶電顆粒在電場(chǎng)作用下移動(dòng)速度不同而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)。在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)中常會(huì)用到4種不同的電泳方法：瓊脂糖凝膠電泳、小板聚丙烯酰胺凝膠電泳、大板聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳。不同的電泳方法適合不同的檢測(cè)項(xiàng)目，各方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器、檢測(cè)技術(shù)水平、實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員的要求也不同。

1 四種不同的電泳方法

1.1 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分子檢測(cè)中常用的檢測(cè)方法，不同濃度的瓊脂糖凝膠（0.3%～1.5%）可以將200bp～50kb的DNA片段分離。當(dāng)用溴化乙啶（EB，熒光嵌入染料）染色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)，能觀察到發(fā)出熒光的DNA條帶，確定DNA片段在凝膠中的位置及質(zhì)量，或與參照DNA比較，判定被檢基因的有無(wú)。瓊脂糖凝膠電泳可以檢出1～10ng的DNA的存在[1]。通常實(shí)驗(yàn)室多用電泳儀和水平槽裝置進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2 小板聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的一種電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）聚合成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。由于電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量電荷或者帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的蛋白質(zhì)、酶或者DNA片段分離開(kāi)[2]。小板聚丙烯酰胺凝膠通常用電泳儀和小板電泳槽進(jìn)行電泳。

1.3 大板聚丙烯酰胺凝膠電泳大板聚丙烯酰胺凝膠電泳原理同小板聚丙烯酰胺凝膠電泳，只是單體和交聯(lián)劑的比例不同，形成大小不同的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠更薄、移動(dòng)距離長(zhǎng)，能將小片段DNA（5～500bp）分離開(kāi)，甚至相差2～5bp的DNA片段也能區(qū)分開(kāi)。根據(jù)Marker或者參照樣品DNA譜帶的位置，可以估測(cè)出被檢樣品DNA片段的大小。大板聚丙烯酰胺凝膠電泳需要高壓電泳儀和大板垂直電泳槽進(jìn)行電泳。

1.4 毛細(xì)管熒光電泳毛細(xì)管熒光電泳是將膠灌在一種空芯的微細(xì)毛細(xì)管中，利用電泳和電滲流的電動(dòng)力學(xué)原理，把PCR產(chǎn)物高效分離，利用熒光檢測(cè)到產(chǎn)物信號(hào)，通過(guò)軟件分析系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成峰值圖導(dǎo)出結(jié)果的電泳技術(shù)。毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法可以將相差1bp的DNA片段分離開(kāi)，通過(guò)不同的峰值圖展示出來(lái)，經(jīng)過(guò)參照樣品和基準(zhǔn)物質(zhì)的矯正，獲得相對(duì)精確的數(shù)據(jù)。在引物上標(biāo)記不同的熒光信號(hào)，可以將若干組不同的PCR產(chǎn)物放在同一個(gè)反應(yīng)孔中電泳，根據(jù)熒光信號(hào)顏色的不同和PCR產(chǎn)物大小的不同，分析出一個(gè)樣品在不同位點(diǎn)的特性值[3]。毛細(xì)管熒光電泳通常在基因分析儀上進(jìn)行。

2 不同電泳方法適合不同的檢測(cè)項(xiàng)目

瓊脂糖凝膠電泳在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)中多用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和DNA質(zhì)量檢測(cè)。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中通過(guò)分析樣品中目標(biāo)DNA片段的有無(wú)與陽(yáng)性對(duì)照基因比較，確定檢測(cè)樣品是陽(yáng)性還是陰性；在分子檢測(cè)中用于檢測(cè)DNA的質(zhì)量，觀察DNA譜帶的位置、整齊度和亮度來(lái)判斷DNA質(zhì)量的好壞。圖1是一個(gè)棉花種子樣品CaMV35S啟動(dòng)子基因的檢測(cè)結(jié)果圖。

圖1 棉花種子CaMV35S基因檢測(cè)結(jié)果

棉花種子樣品1、2、3檢測(cè)出CaMV35S基因，與陽(yáng)性參照結(jié)果相同，其余樣品均未檢出該基因，試驗(yàn)中陽(yáng)性參照樣品和Marker條帶清晰，陰性參照和空白對(duì)照樣品均無(wú)條帶，試驗(yàn)結(jié)果可靠。

小板聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于種子樣品的純度檢測(cè)。在電泳圖譜中觀察分析各個(gè)泳道電泳譜帶的差異，判定樣品的純度，或根據(jù)參照樣品的信息估測(cè)DNA片段的大小。圖2是一個(gè)玉米種子樣品鹽溶蛋白電泳的結(jié)果圖，該圖顯示，此樣品種子一致性較好，無(wú)異品種。

圖2 玉米種子樣品鹽溶蛋白電泳檢測(cè)

大板聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于種子樣品SSR分子標(biāo)記真實(shí)性檢測(cè)和一致性檢測(cè)。根據(jù)不同品種在各個(gè)位點(diǎn)的典型特異譜帶，進(jìn)行樣品之間比較或者與DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，判斷分析種子樣品的一致性和真實(shí)性。圖3是一個(gè)玉米種子樣品SSR分子標(biāo)記方法檢測(cè)引物bnlg2291k4大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖，該圖顯示，這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)4種不同的特異型譜帶，將20個(gè)不同的玉米雜交種分成4種不同的類型。

圖3 玉米種子樣品大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)方法主要用于農(nóng)作物種子的真實(shí)性檢測(cè)和一致性檢測(cè)。分析軟件導(dǎo)出的峰值圖，進(jìn)行合并與整理，比對(duì)指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的指紋，判定被檢種子樣品的身份信息。圖4是20份玉米種子樣品SSR分子標(biāo)記引物bnlg1671y17毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)結(jié)果圖，在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)5種不同大小的特異峰，把20個(gè)不同的玉米品種分成5種不同的類型。

圖4 20份玉米種子樣品毛細(xì)管電泳檢測(cè)

3 不同電泳方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可以分離的DNA片段范圍較廣，且能較好地分離長(zhǎng)度相差較大的DNA片段，操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作技術(shù)人員的要求低；但是該方法需要用到EB，即一種高致癌性的強(qiáng)誘變劑，對(duì)操作人員和環(huán)境的污染較嚴(yán)重，雖然可以用EB替代物（GoldView、GelRed和 GelGreen、SYBR GreenⅠ），但易受到替代物的染色效果和穩(wěn)定性的影響；另外這種方法的精確度較低，要區(qū)分大小相近的DNA片段比較困難。

小板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)操作過(guò)程中灌膠、點(diǎn)樣、電泳、染色等程序操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件、儀器設(shè)備和技術(shù)人員要求不高，但是該方法的檢測(cè)分辨率較低，不能清晰地區(qū)分大小相近的DNA片段。

大板聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)精確度比小板聚丙烯酰胺凝膠電泳高，成本相對(duì)較低，但凝膠制備與電泳、染色等操作程序比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，仍無(wú)法讀出譜帶的精確數(shù)據(jù)，只能與參照樣品比較，估測(cè)它的大小，實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的比對(duì)誤差較大。

毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)方法結(jié)果精確度高，操作簡(jiǎn)單，通量高，省時(shí)省力，但是儀器購(gòu)置、維護(hù)、熒光引物、耗材等試驗(yàn)成本較高；并要求儀器處于適合的溫度條件下，供給穩(wěn)定的電源，實(shí)驗(yàn)室有一定的潔凈度以及有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，以保證儀器的正常運(yùn)行，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的結(jié)果準(zhǔn)確。

4 小結(jié)

在種子質(zhì)量檢測(cè)中，不同的檢測(cè)項(xiàng)目選擇不同的電泳方法。瓊脂糖凝膠電泳是一種理想的檢測(cè)被檢基因有無(wú)和檢測(cè)DNA質(zhì)量的方法；小板聚丙烯酰胺凝膠電泳能區(qū)分親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種，但由于近年來(lái)品種間親緣關(guān)系越來(lái)越近，該方法的應(yīng)用率也在逐年降低；大板聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前種子樣品純度檢測(cè)和真實(shí)性檢測(cè)中較常用的檢測(cè)方法，成本相對(duì)較低；毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)是種子檢測(cè)中精確度較高的一種技術(shù)，但檢測(cè)成本較高，推薦有一定經(jīng)濟(jì)實(shí)力的實(shí)驗(yàn)室使用。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，試驗(yàn)成本的降低，毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)方法是一種自動(dòng)化程度較高、試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、人們較信賴的檢測(cè)方法。