晏子俊 張良明 陳彥清 袁 野 徐興夢

(1 攀枝花市中心醫(yī)院藥學(xué)部，攀枝花，617067； 2 攀枝花市中心醫(yī)院檢驗科，攀枝花，617067)

車前草(PlantagoasiaticaL.)為車前科多年草本植物車前的干燥全草，味甘而性寒，其作為常用的一味中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并被列為上品[1]。車前草的化學(xué)有效成分主要包括揮發(fā)油、三萜及其苷類和黃酮類等[2-6]，其黃酮類成分具有降血脂[7]、降血壓[8]、降血尿酸[9]、抗炎[10]、抗氧化[11]、止咳[12]、殺蟲[13]和清熱利尿[14]等藥理作用，近年來陳蘭英等[14]通過探討車前草對腎小球腎炎大鼠的保護(hù)作用機(jī)制，進(jìn)一步得出車前草對腎小球腎炎大鼠的保護(hù)作用可能與消除氧自由基，避免脂質(zhì)過氧化，減少腎小球纖維化相關(guān)；彭璇和李玉山[15]則探討了車前草總黃酮治療泌尿系結(jié)石可能的作用機(jī)制，并得出車前草治療泌尿系結(jié)石的機(jī)制之一可能是其利尿兼促排作用。目前車前草的相關(guān)研究報道雖已很多，如有效成分[5-6，12，16]、提取[1，4]、藥理活性[14-15，17]等方面的研究，但尚未見針對攀枝花車前草內(nèi)總黃酮提取及其含量測定的相關(guān)報道。本實(shí)驗選用超聲波提取法，以蘆丁作為對照品，采用紫外分光光度法分別測定并比較車前草葉、根內(nèi)總黃酮的含量，為攀枝花車前草的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 微型高速萬能試樣粉粹機(jī)(湖北省黃驊新興電器廠)；UV-VIS3150型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；T6新世紀(jì)紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；KQ 2200 B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；101-2B型恒溫干燥箱(上海滬南電爐烘箱廠)；SHZ-88-水浴恒溫振蕩器(金壇市國旺實(shí)驗儀器廠)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；AB 204 s型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo儀器公司)。

1.2 試劑 車前草(采自攀枝花仁和區(qū))；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；石油醚(分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)；硝酸鋁(分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)；氫氧化鈉(分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)；95%乙醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；蒸餾水(自制)；其他試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 參照文獻(xiàn)[18]報道的研究方法。挖取新鮮車前草葉、根，洗凈后于陽光下晾曬備用，分離出葉、根，烘箱內(nèi)烘干后，置于粉碎機(jī)中粉碎。取一定量車前草粉末加入乙醇中浸泡，于恒溫下振蕩、減壓、抽濾后，將提取液用石油醚萃取3次。將萃取液置于恒溫水浴鍋中濃縮，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至容量中，定容，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 UV-VIS3150型紫外-可見分光光度計，紫外檢測波長為510 nm，測定量為1.5 mL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取10.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品至小燒杯內(nèi)，加入適量60%乙醇溶液使其溶解后，轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶內(nèi)，用60%乙醇溶液稀釋并定容至刻度，即得0.10 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密吸取車前草樣品液2 mL，置于10 mL的容量瓶后，加入70%乙醇溶液定容，即得供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 將配好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液各1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，以試劑空白為參比液，在450～600 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在510 nm波長處兩者均有最大吸收。

2.5 線性關(guān)系考察 分別吸取0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10 mg/mL)至25 mL容量瓶內(nèi)，加入5%的亞硝酸鈉0.70 mL，搖勻，靜置6 min后，加入10%硝酸鋁0.7 mL，搖勻，靜置6 min后，再加入1 mol/L的氫氧化鈉5 mL，搖勻，60%乙醇溶液溶劑定容至刻度，搖勻，靜置12 min后，以試劑空白為參比液，在510 nm波長處比色測定各樣品液吸光度(A)。以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，經(jīng)線性回歸，得回歸方程為：A=4.932 8C+0.005 2，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明濃度在0～50 μg/mL范圍時，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 中間精密度試驗 取對照品溶液于510 nm處測定吸光度，于1 d內(nèi)測定6次，得到日內(nèi)精密度RSD值為0.36%(n=6)，試驗結(jié)果表明該測定方法的日內(nèi)精密度良好。相同條件下，每日測定1次，連續(xù)測定5 d，得到日間精密度RSD值為0.75%(n=5)，試驗結(jié)果表明測定方法的日間精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h在510 nm處測定其吸光度，其RSD為0.68℅(n=6)。試驗結(jié)果表明該溶液穩(wěn)定性良好，能滿足測定的需要。

2.8 重復(fù)性試驗 精密量取6份樣品乙提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，于510 nm處測定其吸光度，得到RSD值為0.84%(n=6)，表明該方法的重現(xiàn)性好，符合分析測定要求。

2.9 回收率試驗 分別取9份1 mL已知總黃酮濃度的車前草根、葉樣品液，分別加入一定量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下的方法，于510 nm處測定其吸光度，代入回歸方程計算回收率，車前草根和葉的平均回收率分別為98.95%和99.55，RSD分別為0.86%和0.53%。見表1、表2。

表1 車前草根的回收率

2.10 提取工藝的單因素試驗

2.10.1 浸泡時間對黃酮提取的影響 以不同的浸泡時間(12 h、24 h、36 h)作為影響因素，測定其一定的稀釋液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，浸泡時間為橫坐標(biāo)得到趨勢圖。見圖2。

浸泡24 h與浸泡12 h比較，浸泡24 h可明顯提高車前草總黃酮的提取率，但當(dāng)浸泡時間為36 h時，并未提高總黃酮提取率，反而有下降的趨勢。因此，若僅考慮提取車前草中總黃酮的最佳浸泡時間應(yīng)為24 h。

表2 車前草葉的回收率

圖2 浸泡時間對黃酮提取的影響

2.10.2 溶劑系統(tǒng)對黃酮提取的影響 以不同的溶劑系統(tǒng)(乙醇濃度為55%、60%、65%、70%、75%、80%)作為影響因素，測定其一定的稀釋液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，乙醇濃度為橫坐標(biāo)得到趨勢圖。見圖3。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取的影響

乙醇濃度為55%～70%時，車前草中總黃酮的提取率隨乙醇濃度增高逐漸升高，而乙醇濃度為70%～80%時，總黃酮的提取率逐漸下降。因此，若僅考慮提取車前草中總黃酮的最佳乙醇濃度應(yīng)為70%。

2.10.3 超聲時間對黃酮提取的影響 以不同的超聲時間(5 min、15 min、25 min、35 min)作為影響因素，測定其一定的稀釋液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，超聲時間為橫坐標(biāo)得到趨勢圖。見圖4。

超聲時間在5 min、15 min、25 min、35 min處理下，25 min處理時更利于車前草中總黃酮的提取，而35 min時總黃酮提取率反而有所下降，可能原因是由于隨著時間的延長，黃酮類化合物易被氧化，而導(dǎo)致提取率下降。因此，若僅考慮提取車前草中總黃酮的最佳超聲時間應(yīng)為25 min。

圖4 超聲時間對黃酮提取的影響

2.11 提取工藝的正交試驗 上述分別討論了各單因素對總黃酮提取率的影響，但實(shí)際操作中，各因素則是相互影響。為綜合考查影響因素，本試驗設(shè)計了以乙醇濃度、浸泡時間、超聲時間等3個因素，每個因素取3水平[19]。見表3。L9(33)正交試驗結(jié)果見表4。

影響提取車前草中總黃酮的3個因素(乙醇濃度、浸泡時間、超聲時間)中，乙醇濃度的影響最大，各因素的影響順序為：乙醇濃度>超聲時間>浸泡時間。最佳提取條件是A3B2C3，即溶劑系統(tǒng)70%乙醇，浸泡時間36 h，超聲時間35 min，其結(jié)果與單因素試驗的考察結(jié)果有所差異。

表3 正交試驗各水平因素

2.12 提取物定性分析

2.12.1 紫外光譜分析 黃酮類化合物具有C6-C3-C6基本結(jié)構(gòu)，故大多數(shù)黃酮類化合物在240～400 nm有2個紫外光譜吸收峰，分別在320～380 nm(光譜帶I：B環(huán)取代基性質(zhì)決定的)、240～270 nm(光譜帶Ⅱ：環(huán)取代基性質(zhì)決定的)2個區(qū)域出現(xiàn)；而蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉處理后，光譜帶I、帶Ⅱ分別轉(zhuǎn)移到450～510 nm、415～470 nm處，車前草提取的樣品液圖譜在510 nm左右的吸收峰基本與其相似[18]。見圖5。

表4 車前草中總黃酮提取正交試驗結(jié)果

圖5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和車前草提取物的紫外吸收光譜

2.12.2 顯色反應(yīng) 黃酮類化合物的碳架含有堿性氧原子，且大部分是酚性羥基衍生物，故其能與某些較強(qiáng)還原劑發(fā)生顏色反應(yīng)、與某些金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[1]。故黃酮類化合物可進(jìn)行如下定性鑒定：1)紫外顯色反應(yīng)：車前草提取液點(diǎn)在濾紙上，可見光下為灰黃色，紫外光下為灰褐色熒光斑點(diǎn)；2)濃氨水反應(yīng)：車前草提取液點(diǎn)在濾紙上，置于氨水上方30 s后，紫外光下為極明顯的黃褐色熒光斑點(diǎn)。3)三氯化鋁反應(yīng)：車前草提取液點(diǎn)在濾紙上，滴入1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干，可見光下為灰黃色，紫外光下為黃色熒光斑點(diǎn)。4)乙酸鎂反應(yīng)：方法同“3)三氯化鋁反應(yīng)”，但滴入1%乙酸鎂甲醇溶液，紫外光下為黃色斑點(diǎn)。5)鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取1 mL車前草提取液置于試管內(nèi)，加入適量鎂粉、數(shù)滴濃鹽酸后，泡沫處變?yōu)樽霞t色。

2.13 樣品測定結(jié)果

2.13.1 車前草根、葉中總黃酮含量的測定 在最優(yōu)條件下即70%乙醇浸泡36 h，超聲時間35 min，對車前草葉、根進(jìn)行總黃酮提取，于平行操作條件下分別測定其吸光度，代入回歸方程，計算出其質(zhì)量濃度。車前草葉、根總黃酮含量有差異，其中車前草根中總黃酮含量大于葉中總黃酮含量。見表5。

表5 車前草根、葉總黃酮含量

2.13.2 車前草中總黃酮含量的測定 精密吸取車前草樣品液2 mL，置于10 mL的容量瓶后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線下的方法，于510 nm處測定其吸光度，A=0.232，代入回歸方程：A=4.932 8C+0.005 2，r=0.999 9(n=7)，計算得到車前草樣品中總黃酮的含量為1.54%。

3 討論

車前草來源廣泛，價格相對較低，不良反應(yīng)也較小，是一種非常有前景的中草藥，其黃酮類成分具有諸多藥理活性作用[20]，李明娟等[20]的進(jìn)一步研究則表明，車前草中黃酮類各化合物的藥理活性具有差異，故其黃酮類化合物的提取工藝、含量測定方法尤為重要，既要保證藥效，也要有利于質(zhì)量控制。

目前，國內(nèi)外研究報道中草藥中總黃酮類成分的提取方法主要有醇提法[8]、微波提取法[21]、雙水相萃取分離法[22]、超臨界流體提取法[22]、超聲波乙醇浸提法[18]等，各提取方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)。而前期的預(yù)實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，在提取攀枝花車前草中總黃酮時，超聲波乙浸提法能最大限度提取到黃酮類成分，并且不破壞提取液樣品中的黃酮類成分，原因可能是乙醇作為溶劑的同時，超聲波可加快中草藥中黃酮類成分進(jìn)入乙醇溶劑，減少提取時間，增加了黃酮類成分的提取率，而且該方法還避免了高溫對黃酮類成分的影響，即減少了對黃酮類成分的破壞。故參考預(yù)實(shí)驗結(jié)果及相關(guān)研究報道[18，23]，本試驗選用超聲波乙醇浸提法作為車前草中總黃酮的提取方法。

中草藥中黃酮類成分的含量測定方法主要有紫外分光光度法[1，18]、一階導(dǎo)數(shù)分光光度法[6]和高效液相色譜法[20]等。本試驗選用了經(jīng)典的紫外分光光度法測定黃酮類成分，方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法精密度和回收率均符合測定要求，并且該方法簡單易行，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于攀枝花車前草中總黃酮的質(zhì)量控制。

本試驗結(jié)果表明，正交試驗得到車前草總黃酮的最優(yōu)提取條件即70%乙醇浸泡36 h，超聲時間35 min，測得攀枝花車前草內(nèi)總黃酮的含量為1.54%，車前草根和葉的平均回收率分別為98.95%和98.18%。同一條件下，測得車前草根中總黃酮含量大于車前草葉中總黃酮含量，該結(jié)果與趙春[24]報道的研究結(jié)果一致。

總之，本試驗用超聲波乙醇浸提法首次對攀枝花車前草中總黃酮進(jìn)行了提取，以蘆丁作為對照品，采用紫外分光光度法測定了總黃酮的含量，具有一定的前瞻性，也為攀枝花車前草的進(jìn)一步開發(fā)和研究奠定了基礎(chǔ)。