丁 山 李淑芳 李 杰 唐 磊 王曉冉 莫照蘭 李 杰 陳 娟

?

鰻弧菌三價滅活疫苗的長期免疫保護(hù)效果*

丁 山1,2李淑芳1,2李 杰2,3唐 磊4王曉冉4莫照蘭2,3①李 杰5陳 娟5

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；4. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266100；5. 山東東方海洋科技股份有限公司 煙臺 264003)

鰻弧菌()是一種能感染多種魚類的條件致病菌，引起高致死率出血性敗血病，流行于我國海水養(yǎng)殖環(huán)境，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。為此，本研究以鰻弧菌O1、O2和O3血清型菌株為抗原，制備了鰻弧菌三價滅活疫苗，以腹腔注射途徑對健康大菱鲆() (80.2±4.7) g進(jìn)行一次免疫，在一次免疫后60 d以同等劑量和途徑進(jìn)行二次免疫。對一免組進(jìn)行150 d的觀測，結(jié)果顯示，大菱鲆血清的3種抗原的特異抗體水平在免疫后14 d顯著升高(<0.05)，免疫后28 d達(dá)到最大值1∶320，免疫后28~150 d穩(wěn)定在1∶106.7~1∶320，在免疫后14~150 d血清抗體效價均顯著高于對照組(<0.05)；相對免疫保護(hù)率(RPS)的檢測結(jié)果顯示，免疫后7 d大菱鲆抵抗鰻弧菌3種血清型病原感染的RPS分別為43.8%、38.9%和16.7%，免疫后28 d RPS均達(dá)最大值100%，免疫后28~120 d的RPS值保持在70%~100%，免疫后150 d的RPS值為35%~100%。對二免大菱鲆觀測了90 d，二免后3~60 d的大菱鲆血清抗體水平顯著高于同期一免的大菱鲆(<0.05)，二免后60~90 d抗體水平下降，與同期一免魚無顯著差異(>0.05)；二免大菱鲆的RPS值均高于70%，高于同期一免大菱鲆。上述結(jié)果顯示，以鰻弧菌三價滅活疫苗一次免疫大菱鲆，抗體持續(xù)期不少于150 d，有效免疫保護(hù)期(RPS>70%)不少于120 d；二次免疫大菱鲆，抗體持續(xù)期和有效免疫保護(hù)期(RPS>70%)均不少于150 d?？瞻捉M最終體重略高于免疫組，但2組的特定生長率(SGR)無明顯差異，說明三價疫苗對大菱鲆生長沒有影響。

鰻弧菌疫苗；抗體效價；RPS；抗體持續(xù)期；免疫保護(hù)期

鰻弧菌()是一種分布廣泛的條件致病菌，能感染多種經(jīng)濟(jì)魚類，引起宿主出血性敗血癥，嚴(yán)重時可導(dǎo)致宿主死亡，造成水產(chǎn)業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失。自首例鰻弧菌商品疫苗——抗弧菌引起的紅嘴病疫苗問世以來，許多學(xué)者投入到鰻弧菌疫苗免疫的研發(fā)中，目前，鰻弧菌疫苗已成功用于養(yǎng)殖魚類的鰻弧菌病防治，如針對大西洋鮭()、虹鱒()、鱈魚()、鱸魚()、鯛魚()、香魚()、大菱鲆()的商品化鰻弧菌疫苗已經(jīng)在挪威、西班牙、日本、韓國及歐洲等國家和地區(qū)得到廣泛應(yīng)用(Plant, 2011)。我國不少學(xué)者也相繼開展了鰻弧菌疫苗的研究，在實驗室階段評價了滅活菌苗(朱開玲等, 2004; 張振冬等, 2007; 潘燕華等, 2009; Zhang, 2012)、口服疫苗(肖鵬等, 2007)、減毒疫苗(Zhang, 2012)、DNA疫苗(Hui, 2009)、亞單位疫苗(Xing, 2017)、疫苗佐劑(Liu, 2015)的免疫保護(hù)效果。其中，滅活疫苗因成本低廉，且能有效對抗胞外細(xì)菌侵襲，被認(rèn)為是水產(chǎn)行業(yè)最理想的疫苗(Sommerset, 2005)。

鰻弧菌血清型十分復(fù)雜，在已知的23種血清型中(Grisez, 1995; Pedersen, 1999)，O1、O2以及部分O3血清型為致病血清型(Pedersen, 1999)，從流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果來看，O1、O2和O3血清型鰻弧菌均在我國海水魚養(yǎng)殖環(huán)境中流行(趙魯寧等, 2011)。然而，目前國內(nèi)鰻弧菌疫苗的研究均為以單個血清型為抗原的單價疫苗，而且很少進(jìn)入中試臨床研究階段。為填補這一空白，本研究以鰻弧菌O1、O2和O3血清型菌株為疫苗株，制備了三價疫苗，免疫大菱鲆后監(jiān)測該疫苗的抗體持續(xù)期和免疫保護(hù)期，旨在獲取鰻弧菌三價疫苗的免疫效力數(shù)據(jù)，推動鰻弧菌三價疫苗的臨床中試研究。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

鰻弧菌VAM003(O1血清型)、VAM007(O2血清型)和M2016261(O3血清型)分離自患病海水養(yǎng)殖魚，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所病研室保藏，復(fù)壯后保存于–80℃冰箱。實驗所用液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)或含有3%葡萄糖的TSB，固體培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯平板(TSA，TSB+1.5%瓊脂)。培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min。

1.2 實驗用魚

實驗大菱鲆購自山東省煙臺市東方海洋科技有限公司，體重為(80.2±4.7) g，體長為(12.0±0.34) cm。實驗魚暫養(yǎng)于7 m×7 m×1 m水泥池中，每天早、中、晚各投喂1次，按魚體重的1.2%~1.5%進(jìn)行投喂，每次投喂后均換水1次，每次換水量約為池水總體積的2/3，養(yǎng)殖水溫為14~16℃。實驗前，隨機(jī)取3~5尾魚進(jìn)行細(xì)菌分離，確定從魚的肝、脾、腎中均無細(xì)菌檢出后，暫養(yǎng)魚方可用于后續(xù)實驗。

1.3 疫苗制備

將3株菌(VAM003、VAM007和M2016261)從–80℃冰箱接出，在TSA平板上活化，28℃恒溫培養(yǎng)。挑取3~5個單菌落接種到5 ml TSB試管，在28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)過夜得到種子液，再將種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接到200 ml TSB(含3%葡萄糖)，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。取24 h培養(yǎng)產(chǎn)物，向培養(yǎng)產(chǎn)物中加入37%福爾馬林溶液至甲醛終濃度為0.2% ()，在28℃、150 r/min條件下滅活。取滅活12 h和24 h時的菌液分別種到TSA平板和TSB試管，均無活菌檢出后，確定完全滅活。將滅活完全的菌液6000 r/min、4℃離心10 min，收集菌體，用PBS緩沖液(0.2 mol/L, pH=7.6)洗滌2遍，再用含有0.1%甲醛的PBS緩沖液懸浮菌體，將3種菌懸液調(diào)整到相同OD600 nm，按1∶1∶1比例混合制備109cells/ml的三價滅活，在4℃保存待用。

1.4 疫苗免疫大菱鲆

實驗于2016年5月~2016年10月在山東東方海洋科技股份有限公司進(jìn)行，共計150 d。將暫養(yǎng)大菱鲆分為2組(免疫組和對照組)，每組2500尾。免疫組用連續(xù)注射器(德國漢克薩斯)將濃度為109cells/ml的三價疫苗腹腔注射大菱鲆，注射量為0.1 ml/尾，即免疫劑量為108cells/尾；對照組注射等量的滅菌PBS。在一次免疫后60 d，以同等劑量對疫苗免疫的大菱鲆進(jìn)行二次免疫，二免魚尾鰭打上橘色標(biāo)簽后與一免魚混養(yǎng)。

1.5 血清抗體效價檢測

在首次免疫后3、7、14、21、28、44、56、63、70、77、90、120、150 d，免疫組和空白組分別隨機(jī)取5尾魚，從尾靜脈取血；二次免疫后3、7、14、21、28、44、60、90 d，從二免組中隨機(jī)取5尾魚，從尾靜脈取血。所得血液析出血清后，將各尾魚的血清等體積混合，分裝后于–80℃保存。分別以VAM003、VAM007和M2016261滅活細(xì)胞(108cells/ml)為抗原，用微量凝集法(Nguyen, 2017)檢測血清抗體效價。具體方法步驟為：將血清按2n梯度稀釋，將各組稀釋好的血清按稀釋倍數(shù)由低到高逐孔加入96孔板中，每孔50 μl，每個血清樣品設(shè)置3個重復(fù)。將抗原等體積逐孔加入96孔板并吹打混勻，放入28℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，轉(zhuǎn)入4℃靜置15 h，用倒置顯微鏡觀察凝集情況。以能觀察到凝集反應(yīng)的最大血清稀釋倍數(shù)為血清抗體效價，效價值以log2(為最大稀釋倍數(shù))表示。

1.6 相對免疫保護(hù)率檢測

在免疫后7、14、28、60、90、120及150 d，二免后30、60和90 d，從各免疫組和PBS對照組大菱鲆取魚，20尾/組，用VAM003、VAM007和M2016261活菌進(jìn)行攻毒。攻毒前取對照組魚評估各菌株的LD50(50% lethal dose, 半數(shù)致死量)，以10倍LD50作為攻毒濃度，確定7~90 d的攻毒濃度為107CFU/ml，120~150 d的攻毒濃度為108CFU/ml。攻毒時，從魚的背部肌肉注射0.1 ml/尾。攻毒后觀察魚發(fā)病癥狀，待死亡情況穩(wěn)定后(即攻毒后14 d)統(tǒng)計累計死亡數(shù)，按照如下公式計算疫苗的相對免疫保護(hù)率(Relative percent survival, RPS)：

RPS=(1–免疫組死亡率/對照組死亡率)×100% (Amend, 1981)。

1.7 實驗魚體重檢測

分別于首次免疫后0、67、83、126、150 d，從免疫組和對照組隨機(jī)取魚30尾檢測實驗魚體重，并計算其特定生長率(SGR)：

SGR=(lnf–lni)/×100%

式中，f、i和分別為終末體重(g)、初始體重(g)和養(yǎng)殖天數(shù)(d)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

血清抗體效價表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean± SD)，用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗標(biāo)準(zhǔn)采用Duncan法，以<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 血清特異性抗體效價

以劑量為108cells/尾的三價菌苗一次注射免疫大菱鲆后，在不同的時間取免疫組魚和對照組魚的血清，檢測VAM003、VAM007和M2016261的抗體效價。如圖1所示，在整個實驗期間對照組魚的抗體效價在1∶2.0~1∶5.1波動，而免疫魚的血清抗體效價呈現(xiàn)先快速升高后保持相對穩(wěn)定的趨勢。免疫后14 d即可檢測到3種抗體水平在1∶66.7~1∶80，顯著高于對照組(1∶2.0~1∶2.9)(<0.05)，3種抗體水平在免疫后28 d均上升到最高水平1∶320.0(<0.05)，在28~150 d穩(wěn)定保持在較高水平，為1∶106.7~1∶320.0，顯著高于同時期對照組魚的抗體水平(1∶3.0~ 1∶5.1)(<0.05)。結(jié)果表明，以劑量為108cells/尾的鰻弧菌三價菌苗一次注射免疫大菱鲆，3種抗體的持續(xù)期超過150 d。

二次免疫后60 d內(nèi)，與同期一免魚相比，二免魚3種抗體水平均顯著提高(<0.05)(圖1)。在二免后3 d可檢測到二免組抗體水平快速上升，3種抗體水平分別為1∶160.0(VAM003)、1∶213.3(VAM007)和1∶320.0(M2016261)，均不低于同期一免魚(63 d)的抗體水平，1∶160.0(VAM003)、1∶160.0(VAM007)和1∶177.7(M2016261)；在二免后14 d，3種抗體水平分別為1∶320.0(VAM003)、1∶640.0(VAM007)和1∶640.0(M2016261)，顯著高于同時期一免魚(70 d)的抗體水平，1∶133.3(VAM003)、1∶151.1(VAM007)和1∶284.4(M2016261)，并且二免后14~60 d，M2016261的抗體效價保持在最高水平；二免后90 d，3種抗體水平分別下降至1∶213.3(VAM003)、1∶68.9 (VAM007)和1∶151.1(M2016261)，與同期一免魚(150 d)的抗體水平無顯著差異(>0.05)。上述結(jié)果表明，二次免疫能夠顯著提高三價疫苗的抗體水平。

圖1 鰻弧菌三價疫苗免疫大菱鲆后的血清抗體效價

2.1 相對免疫保護(hù)率

在一次免疫后的不同時間，用VAM003、VAM007和M2016261分別對免疫大菱鲆進(jìn)行攻毒，評估三價疫苗的免疫保護(hù)率。如圖2所示，大菱鲆免疫后7 d獲得RPS分別為43.8%(VAM003)、38.9%(VAM007)、16.7%(M2016261)；在一免后14~120 d，針對3種病原的攻毒，免疫大菱鲆的RPS為70%~100%；一免后150 d，免疫魚獲得的RPS分別為35%(VAM003)、65%(VAM007)和100%(M2016261)。

在二免后30、60和90 d進(jìn)行疫苗RPS的檢測。與同期的一免大菱鲆相比，二免大菱鲆的RPS均有所提高；特別是，二免后90 d的大菱鲆獲得的RPS為75%(VAM003)、90%(VAM007)、100%(M2016261)，高于同期一免后150 d的大菱鲆。結(jié)果表明，加強(qiáng)免疫后，大菱鲆獲得的RPS提高。若以RPS>70%為有效免疫保護(hù)期，則一免大菱鲆的有效免疫保護(hù)期為14~120 d，加強(qiáng)免疫后有效免疫保護(hù)期超過150 d，加強(qiáng)免疫后免疫保護(hù)期明顯延長。

圖2 鰻弧菌三價疫苗免疫大菱鲆后的免疫保護(hù)率

2.2 免疫過程中魚體長和體重的變化

實驗過程中，不定期從免疫組和對照組取魚測量其體重，并計算特定生長率(SGR)，結(jié)果如圖3所示。免疫組的SGR(0.76)稍低于對照組(0.78)，但二者沒有明顯差別，表明鰻弧菌三價疫苗對大菱鲆的生長未產(chǎn)生不良影響。

圖3 免疫后大菱鲆體重增長

3 討論

本研究以鰻弧菌的O1、O2和O3血清型菌株為抗原，制備了鰻弧菌三價滅活疫苗對養(yǎng)殖大菱鲆進(jìn)行了一次免疫和二次免疫，結(jié)果顯示，鰻弧菌三價疫苗對大菱鲆起到了有效的免疫保護(hù)作用。在整個實驗期間，免疫組大菱鲆的生長與未免疫大菱鲆未有明顯區(qū)別，表明該疫苗對大菱鲆的生長沒有影響。免疫苗血清抗體效價是評價疫苗免疫保護(hù)效果的重要參數(shù)之一，實驗結(jié)果顯示，鰻弧菌三價疫苗能夠有效地刺激大菱鲆產(chǎn)生特異抗體，3種抗原的抗體水平在短期內(nèi)快速上升到最高水平，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，在檢測的150 d里保持較高水平。Spinos等(2017)的實驗也得到了相似結(jié)果，他們以鰻弧菌O1血清型菌株和美人魚發(fā)光桿菌()為抗原制備的二聯(lián)疫苗免疫歐洲鱸魚()，免疫后22~29 d針對鰻弧菌的特異抗體水平上升到最高，并在免疫后346 d保持相對穩(wěn)定的抗體水平。本研究發(fā)現(xiàn)，一免后7 d免疫組的3種特異抗體的水平迅速升高，說明鰻弧菌疫苗抗原能夠快速地被大菱鲆機(jī)體免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。鰻弧菌滅活疫苗的主要抗原成分為脂多糖LPS(O抗原)(Schr?der, 2006)，LPS不需要抗原遞呈細(xì)胞的加工處理便能直接激活B細(xì)胞誘導(dǎo)體液免疫，因而，能在較短時間內(nèi)刺激特異抗體的產(chǎn)生。

相對免疫保護(hù)率RPS是評價免疫保護(hù)效果的另一個重要參數(shù)，結(jié)果表明，鰻弧菌三價疫苗能為免疫魚提供很好的免疫保護(hù)。大菱鲆在一免后7 d便獲得較高的RPS，在免疫后14~120 d針對3種抗原的RPS維持在70%以上。這些結(jié)果表明，鰻弧菌三價疫苗一次免疫大菱鲆，能提供至少120 d的有效免疫保護(hù)期。一次免疫大菱鲆獲得的RPS的變化趨勢與特異抗體水平的變化趨勢一致，一免后14 d血清抗體顯著升高的同時，RPS也明顯升高；免疫后28 d，血清抗體效價達(dá)最大值，RPS也達(dá)到最大值100%；免疫后28~120 d血清抗體水平維持在較高水平(>1∶106)，RPS維持在70%以上。RPS與特異抗體水平的一致性說明疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用主要來自于抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，Sun等(2011)也提出了相同觀點。此外，RPS與抗體效價間的相關(guān)性提示，可以通過免疫魚的特異抗體水平來預(yù)測RPS，但還需要多次重復(fù)實驗來建立抗體水平與RPS的數(shù)值關(guān)系。

二次免疫能夠提高宿主的抗體水平、延長抗體持續(xù)時間，從而延長疫苗的免疫保護(hù)期。為了探究鰻弧菌三價疫苗二次免疫的免疫保護(hù)效果，在一免后60 d對大菱鲆進(jìn)行了二次免疫，并對比了二免魚和一免魚特異抗體的變化和RPS。結(jié)果顯示，在二免后3 d便檢測到二免魚的特異抗體水平顯著高于同期一免魚的抗體水平，并在60 d內(nèi)維持較高于一免魚的抗體水平，表明大菱鲆的免疫系統(tǒng)對鰻弧菌疫苗快速產(chǎn)生了二次免疫應(yīng)答，并合成和分泌更多的特異抗體。同時，二免后，大菱鲆獲得的RPS也顯著高于同期的一免大菱鲆，有效免疫保護(hù)期(RPS>70%)大于150 d，表明鰻弧菌三價疫苗進(jìn)行二次免疫后能夠提高大菱鲆的免疫保護(hù)率、延長免疫保護(hù)時間。加強(qiáng)免疫時殘留的疫苗抗體滴度直接影響抗體應(yīng)答，且通常表現(xiàn)為負(fù)影響?？赡苁切纬闪丝乖C抗體復(fù)合物，降低了可與B細(xì)胞結(jié)合的抗原量。通常一般會在宿主的特異抗體效價下降到較低、RPS也較低的時候進(jìn)行二次免疫，以便有效延長抗體持續(xù)時間和免疫保護(hù)期。在本研究中，一免大菱鲆的特異抗體水平在免疫后150 d仍保持較高水平，而RPS在120 d已下降至70%，因此，認(rèn)為鰻弧菌三價滅活疫苗的二免時間在首次免疫后120 d左右較合適。

綜上所述，鰻弧菌三價滅活疫苗為大菱鲆提供了有效的免疫保護(hù)，一次免疫的抗體持續(xù)期大于150 d，有效免疫保護(hù)期不低于120 d；二次免疫的抗體持續(xù)期大于150 d，有效免疫保護(hù)期不低于150 d。在整個實驗期間，免疫后的大菱鲆的生長與未免疫大菱鲆沒有明顯區(qū)別。

Amend DF. Potency testing of fish vaccine. Developments in Biological Standardization, 1981, 49: 447–454

Frans I,Michiels CW,Bossier P,.as a fish pathogen: Virulence factors, diagnosis and prevention. Journal of Fish Diseases, 2011,34(9): 643–661

Grisez L, Ollevier F. Comparative serology of the marine fish pathogen. Applied & Environmental Microbiology, 1995, 61(12): 4367

Hui Y, Chen JX, Yang GP,. Protection of Japanese flounder () againstwith a DNA vaccine containing the mutated zinc-metalloprotease gene. Vaccine, 2009, 27(15): 2150

Liu X, Hua Z, Yuan G,. Efficacy of chitosan oligosaccharide as aquatic adjuvant administrated with a formalin- inactivated, vaccine. Fish & Shellfish Immunology, 2015, 47(2): 855–860

Nguyen HT, Thu Nguyen TT, Tsai MA,. A formalin- inactivated vaccine provides good protection againstinfection in orange-spotted grouper (). Fish & Shellfish Immunology, 2017, 65: 118–126

Pan YH, Ma Y, Zhao DL,. Study on immune response ofinduced by live attenuatedvaccine. Food and Drug, 2009(5): 12–15 [潘燕華, 馬悅, 趙東玲, 等. 鰻弧菌減毒活疫苗對牙鲆免疫效果的研究. 食品與藥品, 2009(5): 12–15]

Pedersen K, Grisez L, Houdt RV,. Extended serotyping scheme forwith the definition and characterization of seven provisional o-serogroups. Current Microbiology, 1999, 38(3): 183–189

Plant KP, Lapatra SE. Advances in fish vaccine delivery. Developmental & Comparative Immunology, 2011, 35(12): 1256

Schr?der MB, Mikkelsen H, B?rdal S. Early vaccination and protection of Atlantic cod (L.) juveniles against classical vibriosis. Aquaculture, 2006, 254(1): 46–53

Sommerset I, Kross?y B, Biering E,. Vaccines for fish in aquaculture. Expert Review of Vaccines, 2005, 4(1): 89–101

Spinos E, Kokkoris GD, Bakopoulos V. Prevention of sea bass (, L. 1758) photobacteriosis and vibriosis. Long term efficacy study of intraperitoneally administered bivalent commercial vaccines. Aquaculture, 2017, 471: 172–184

Sun Y, Liu C, Sun L. A multivalent killed whole-cell vaccine induces effective protection againstand. Fish & Shellfish Immunology, 2011, 31(4): 595–599

Xiao P, Mo ZL, Zou YX,. Immune responses and efficacy of an oral-emulsified bivalent vaccine againstin turbot (). Chinese High Technology Letters, 2007, 17(9): 979–985 [肖鵬, 莫照蘭, 鄒玉霞, 等. 鰻弧菌油乳化二價口服疫苗免疫養(yǎng)殖大菱鲆的免疫應(yīng)答及免疫效果的研究. 高技術(shù)通訊, 2007, 17(9): 979–985]

Xing J, Xu H, Wang Y,. Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins ofand evaluation them as vaccine candidate for flounder (). Microbial Pathogenesis, 2017, 107: 155

Zhang Z, Wu H, Xiao J,. Immune responses of zebrafish () induced by bath-vaccination with a live attenuatedvaccine candidate. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 33(1): 36

Zhang ZD, Zhang PJ, Mo ZL,. Effect of inactivtedvaccine on phagocytosis ofperipheral blood cells. Studia Marine Sinica, 2007, 48: 132–137 [張振冬, 張培軍, 莫照蘭, 等. 鰻弧菌滅活疫苗對牙鲆外周血細(xì)胞吞噬活性的影響. 海洋科學(xué)集刊, 2007, 48: 132–137]

Zhao LN, Li GY, Li J,. Serotyping and antibiotics sensitivity ofstarins isolated from marine farmed fish. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2015, 46(5): 1109–1118 [趙魯寧, 李貴陽, 李杰, 等. 海水養(yǎng)殖魚類鰻弧菌()臨床分離株的血清型和抗生素耐藥譜. 海洋與湖沼, 2011, 46(5): 1109–1118]

Zhu KL, Chen JX, Li Y,. Study on the vaccination againstin farmed marine turbot. High Technology Letters, 2004, 14(2): 76–80 [朱開玲, 陳吉祥, 李筠, 等. 鰻弧菌滅活疫苗對海水養(yǎng)殖大菱鲆的免疫預(yù)防研究. 高技術(shù)通訊, 2004, 14(2): 76–80]

Long-Term Protection Effect ofTrivalent Inactivated Vaccine

DING Shan1,2, LI Shufang1,2, LI Jie2,3, TANG Lei4, WANG Xiaoran4, MO Zhaolan2,3①, LI Jie5, CHEN Juan5

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 4. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266100; 5. Shandong Oriental Ocean Technology Limited Liability Company, Yantai 264003)

is a pathogen that can infect a variety of fish and causes highly fatal hemorrhagic septicemia. Its O1, O2, and O3 serotype strains are prevalent in the mariculture environment of China, causing great economic loss. However, the study of polyvalent vaccines of different pathogenic serotypes ofhas not been undertaken. For this purpose, a trivalent inactivated vaccinewas made, and its antibody duration and immune protection period were evaluated. The trivalent vaccine was administered to turbot (80.2±4.7 g) at a dose of 108cells/individualintraperitoneal injection; booster vaccination was given at 60 days post vaccination (dpv), and the serum antibody titer and RPS of the vaccinated group and control group were compared. Fish vaccinated only once were observed for 150 days, and the results showed that during 14~150 dpv, the antibody level of the vaccinatedgroup was significantly higher than that in the control group (<0.05), and rose to 1∶6.7 at 7 dpv, reached peak value at 28 dpv, and during 28~150 dpv hovered between 1∶106.7~1∶320. RPS of three serotypewere 16.7%~43.8% for 7 dpv, then reached 100% at 28 dpv; during 28~120 dpv was 70%~100%, 35%~100% for 150 dpv. The fish vaccinated twice were observed for 90 days; during 3~60 days post-second vaccination (dpsv), their antibody titer was significantly higher (<0.05) than those vaccinated only once, then went down and was not significantly different (>0.05) than that of those vaccinated only once. RPS of three serotypewere still higher than 70% and higher than those of fish only vaccinated once. All in all, antibody durability and efficient immune protection period (RPS>70%) of fish vaccinated withtrivalent inactivated vaccine once was longer than 150 days and 120 days respectively, and 150 days for fish that were vaccinated twice. Control group fish reached higher weight in comparison to the vaccinated fish, while SGR between groups for the whole period was not statistically significant (>0.05).

vaccine; Serum antibody titer; RPS; Antibodies durability; Immune protection period

* 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2016HY-ZD0505)和青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室鰲山科技創(chuàng)新計劃項目(2015ASKJ02)共同資助 [This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Science (2016HY-ZD0505), and Aoshan S&T Innovation Project from Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 丁 山，E-mail: 13122410021@163.com

莫照蘭，研究員，E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

MO Zhaolan, E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

2017-09-06,

2017-10-10

10.19663/j.issn2095-9869.20170906001

丁山, 李淑芳, 李杰, 唐磊, 王曉冉, 莫照蘭, 李杰, 陳娟. 鰻弧菌三價滅活疫苗的長期免疫保護(hù)效果. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 137–142 Ding S, Li SF, Li J, Tang L, Wang XR, Mo ZL, Li J, Chen J. Long-term protection effect oftrivalent inactivated vaccine. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 137–142

S942.1

A

2095-9869(2018)05-0137-06

(編輯 馮小花)