賈沛茹 劉芳 柳汀 蔡揚(yáng)

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是一種常見的口腔黏膜慢性炎性疾病，典型病理表現(xiàn)為上皮固有層有以T細(xì)胞為主的大量淋巴細(xì)胞呈密集帶狀浸潤[1]。 越來越多的研究支持細(xì)胞免疫異常在OLP病因機(jī)制中的作用[2]。據(jù)報道Th17和Treg細(xì)胞均參與了OLP的局部免疫反應(yīng)[3-6]。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、qPCR技術(shù)分別檢測IL-17、FOXP3、TGF-β1的表達(dá)和分布以及IL-17、RORc和FOXP3mRNA的表達(dá)情況，探討Th17/Treg平衡在OLP局部病損中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

口腔黏膜組織標(biāo)本選自2010～2015 年就診于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔黏膜?？频某踉\患者41 例(非糜爛型20 例，糜爛型21 例)，年齡18～65 歲，經(jīng)臨床和病理確診為OLP(診斷參考[1])。根據(jù)病損基底部黏膜是否伴有糜爛分為非糜爛型和糜爛型。均無系統(tǒng)及免疫性疾病，不伴皮損，未經(jīng)過任何治療。對照組15 例來自正頜外科手術(shù)的正?？谇火つ?。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人IL-17多抗、兔抗人FOXP3多抗(Proteintech, 美國)；鼠抗人TGF-β1單抗(eBioscience，美國)；DAB(北京中杉)；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit(TakaRa，日本)；熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX96，美國)；核酸蛋白分析儀(Gene Quant 100，美國)；YS100光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)；qPCR引物序列(上海生工)詳見表 1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化 免疫組化超敏二步法檢測OLP病損組織切片中IL-17、FOXP3、TGF-β1的表達(dá)。檢測IL-17時采用微波抗原修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液；中火8 min，斷火5 min，中火6 min)；檢測FOXP3和TGF-β1時用高溫高壓修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液；3 min)。一抗?jié)舛龋篒L-17多抗(1∶50)，F(xiàn)OXP3多抗(1∶50)，TGF-β1單抗(1∶500)。二抗用PV6001山羊抗兔IgG/HRP聚合物。操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行，以PBS代替一抗作為空白對照。

結(jié)果判讀:陽性染色表現(xiàn)為棕黃色顆粒。IL-17和TGF-β1染色后主要位于胞漿中，F(xiàn)OXP3主要位于胞核中。采用盲法在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察每片5 個×400 倍視野(參照Fu等[7]的方法計(jì)算分析)。陽性細(xì)胞≤5%為0 分；6%～25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；>75%為4 分。細(xì)胞染色強(qiáng)度:不染色計(jì)0 分;淡黃色計(jì)1 分; 棕黃色計(jì)2 分; 棕褐色計(jì)3 分。采用兩計(jì)分方法之積進(jìn)行結(jié)果判定，并計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)平均百分比。0～2 分為陰性(-)，3～5 分為弱陽性(+)，6～8 分為中度陽性(++)，9～12 分為強(qiáng)陽性(+++)。將+～+++都?xì)w為陽性表達(dá)。

1.3.2 qPCR 取樣本組織約50 mg，Trizol法提取總RNA，并測定A260/A280值，估計(jì)RNA純度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按FastStart Essential DNA Green Master試劑盒說明書在冰上操作，配制10μl qPCR反應(yīng)體系(表 2)。在熒光定量PCR儀中進(jìn)行95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s完成后面的39 個循環(huán)。通過擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析排除非特異性擴(kuò)增，每個樣本重復(fù)2 次，使用2-△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

表 2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(四分位間距)進(jìn)行描述,2 組間均數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 OLP中IL-17、FOXP3和TGF-β1的表達(dá)

41 例OLP中有35 例(85.37%)見大量的IL-17陽性表達(dá)在固有層淋巴細(xì)胞中；少量IL-17散在分布于正?？谇火つさ纳掀ぜ吧掀は聦咏櫟募?xì)胞，陽性表達(dá)率20.00%(3/15)。OLP中FOXP3陽性表達(dá)率為87.80%(36/41)，陽性細(xì)胞主要位于固有層淺層淋巴細(xì)胞中；正常黏膜組織中陽性率為13.33%(2/15)，散在分布于上皮及上皮下層浸潤的細(xì)胞。TGF-β1在OLP中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性率為82.93%(34/41)，主要分布于固有層淋巴細(xì)胞中；而在正常口腔黏膜陽性率為13.33%(2/15)，主要分布于基底層、棘層及顆粒層；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，OLP病損中IL-17、FOXP3和TGF-β1的陽性表達(dá)率均顯著高于正常對照組(P<0.01)(圖 1，表 3)。

2.2 OLP病損組織中IL-17、RORc、FOXP3mRNA的表達(dá)

OLP病損中IL-17、RORc、FOXP3mRNA的相對表達(dá)量高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z1=-2.44,Z2=-2.95,Z3=-2.41;P<0.05)；但OLP兩型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖 2)。

圖 1 IL-17、FOXP3和TGF-β1在正常對照組及OLP固有層淋巴細(xì)胞的表達(dá)(×400)

表 3 IL-17、FOXP3和TGF-β1在OLP組織中的表達(dá)

圖 2 非糜爛型、糜爛型OLP病損組織和對照組中IL-17、RORc、FOXP3mRNA的表達(dá)

Spearman相關(guān)性分析顯示RORc與FOXP3mRNA的相對表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.69,P<0.05)。糜爛型OLP中RORc/FOXP3高于正常組(P<0.05)；但非糜爛型OLP與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2)。

3 討 論

OLP是一種較常見病因未明的口腔黏膜慢性炎性疾病。目前大部分的研究支持免疫因素在OLP病因及發(fā)病機(jī)制中的作用。研究表明不僅Th17細(xì)胞在OLP的發(fā)病起中到重要作用，而且Treg細(xì)胞也參與其中[3-6]。但是2 種細(xì)胞數(shù)量變化及它們與OLP臨床分型間的關(guān)系不盡相同。

Th17細(xì)胞以分泌高水平的IL-17為特征，具有強(qiáng)大的促炎作用并參與多種自身免疫性及炎性疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示OLP病損中IL-17的陽性表達(dá)率顯著高于對照組(P<0.01)，推測Th17細(xì)胞在OLP局部病損組織中發(fā)揮著促炎作用。目前，學(xué)者們認(rèn)為OLP病損中Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子如IL-17、IL-23、IL-22的表達(dá)均高于正常組[8-10]。有研究[4]指出CD4+IL-17+細(xì)胞數(shù)量在正常對照組、斑紋型與糜爛型OLP中有增高趨勢, 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Piccinni等[11]只在糜爛型OLP病損中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子的表達(dá)高于正常組，因此他們認(rèn)為Th17細(xì)胞參與了糜爛型OLP的致病過程。鑒于以上不同觀點(diǎn)，本研究通過定量檢測Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-17及特征性轉(zhuǎn)錄因子RORc發(fā)現(xiàn)OLP中IL-17及RORcmRNA均高于對照組(P<0.05)，表明Th17細(xì)胞參與了OLP的局部病理反應(yīng)。然而它們在OLP兩型中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測Th17細(xì)胞分泌的促炎因子IL-17與疾病的嚴(yán)重程度無關(guān)。

與Th17細(xì)胞功能不同，Treg細(xì)胞在外周免疫耐受的維持中發(fā)揮核心作用[12]。它主要通過細(xì)胞依賴的抑制作用或者釋放細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等發(fā)揮抗炎作用。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3(FOXP3)被認(rèn)為是Treg群體功能和發(fā)展中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究免疫組化及qPCR結(jié)果均顯示，OLP病損中FOXP3表達(dá)增加(P<0.05)，提示Treg細(xì)胞參與了OLP的局部病理反應(yīng)。本研究進(jìn)一步檢測了Treg的細(xì)胞因子TGF-β1，發(fā)現(xiàn)它在OLP固有層中呈強(qiáng)陽性表達(dá)且高于對照組(P<0.05)。研究表明TGF-β1在下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和控制自身免疫中發(fā)揮著重要作用[13]。Sugerman等[14]發(fā)現(xiàn)OLP淋巴細(xì)胞中TGF-β1和TβR-Ⅰ表達(dá)幾乎缺失，提示TGF-β1/TβR-Ⅰ信號通路在OLP細(xì)胞免疫中存在障礙，推測OLP局部病損中由于TGF-β1受體途徑障礙導(dǎo)致Treg細(xì)胞增殖。

本研究OLP病損中RORc與FOXP3mRNA的相對表達(dá)量呈正相關(guān)，提示Th17細(xì)胞的改變可能協(xié)同Treg細(xì)胞參與了OLP的免疫調(diào)節(jié)過程。目前Th17/Treg平衡在OLP中的研究較少，為了探討其在OLP局部病損致病機(jī)制中的作用，本研究進(jìn)一步分析了RORc/FOXP3的變化，發(fā)現(xiàn)糜爛型OLP高于對照組(P<0.05)，但非糜爛型OLP與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測Th17/Treg失衡可能參與了糜爛型OLP的致病過程，這與謝三祥等[5]結(jié)論一致。為探尋失衡原因，本研究中IL-17及RoRc在OLP中都升高，推測Th17細(xì)胞通過分泌IL-17發(fā)揮促炎作用。與謝三祥等[5]觀點(diǎn)不同，IL-17及RoRc的表達(dá)與OLP臨床分型無關(guān)，可能是不同研究組中研究對象本身免疫狀態(tài)差異造成的。此外，TGF-β1增高提示Treg抗炎作用可能由于TGF-β1受體途徑障礙導(dǎo)致Treg細(xì)胞的增殖。Th17與Treg細(xì)胞關(guān)系復(fù)雜，分化途徑相同，功能相反，還可相互轉(zhuǎn)化。對于OLP中Th17/Treg平衡的確切調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究表明Th17/Treg失衡可能參與了糜爛型OLP病損的形成。對Th17/Treg細(xì)胞平衡調(diào)控的深入研究,將可能為OLP患者的治療提供新的靶點(diǎn)。