張冬梅 徐婉悅 潘佳雨 徐秋芳

白色念珠菌作為人體正常菌群之一，可存在于口咽、胃腸道和陰道粘膜表面。同時(shí)白色念珠菌也是重要的機(jī)會(huì)致病性真菌，當(dāng)宿主局部微環(huán)境失調(diào)或粘膜屏障受損時(shí)，白色念珠菌可造成粘膜感染，引發(fā)鵝口瘡、霉菌性陰道炎、間擦疹等疾病[1-4]。在引發(fā)疾病的過(guò)程中，白色念珠菌侵入宿主上皮細(xì)胞，在致病初期起至關(guān)重要的作用。甚至在某些情況下，白色念珠菌還可侵入粘膜上皮引起易感人群血行播散性感染[5]，侵犯皮膚、組織、器官等引起不同程度的白色念珠菌病。

近20 年來(lái)，國(guó)外已有多種組織工程模型如陰道上皮模型、口腔上皮模型、食管上皮模型和皮膚模型用于念珠菌感染的研究[6-7]?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)對(duì)白色念珠菌的黏附、侵入、及對(duì)組織細(xì)胞破壞作用的研究主要集中在體外真菌培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，但體外真菌培養(yǎng)不能反映宿主因素，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的生理環(huán)境與人類差異較大[8]。本研究擬利用口腔黏膜上皮細(xì)胞及膠原凝膠證實(shí)構(gòu)建口腔黏膜上皮體外模型的可行性，進(jìn)一步建成白色念珠菌侵入的口腔黏膜上皮體外模型，為后期白色念珠菌—宿主上皮的相互關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及真菌來(lái)源 口腔粘膜上皮細(xì)胞(KB細(xì)胞株，ATCC CCL17)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC 11006)購(gòu)自中科院微生物研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 DMEM低糖培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基(YPD 固體培養(yǎng)基)、沙堡液體培養(yǎng)基(YPD液體培養(yǎng)基)(Gibco公司，美國(guó));0.4 μm Transwell 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司，美國(guó))。 膠原溶液(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 制備中和溶液 2.7 g DMEM粉末溶于60 ml雙蒸水，過(guò)濾除菌。加入10 ml 7.5%碳酸氫鈉溶液、7.5 ml 3M HEPES, 20 ml熱滅活的胎牛血清、2 ml 10 mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2.2 膠原凝膠制備 200 μl 2 mg/ml的膠原溶液置于Transwell 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板小室中，加入10 μl中和溶液，37 ℃下孵育15 min，待膠原溶液聚合成凝膠狀。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇KB細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)液重懸處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KB細(xì)胞，使?jié)舛葹?×106個(gè)活細(xì)胞/ml，取100 μl細(xì)胞懸液接種至已制備好的Transwell 24孔板凝膠上，取600 μl DMEM培養(yǎng)液置于Transwell下室，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞單層融合后，形成口腔黏膜上皮體外模型。

1.2.4 白色念珠菌培養(yǎng)及懸液制備 將白色念珠菌以劃線法接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)。取新形成的成熟白色念珠菌菌落，轉(zhuǎn)種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中， 30 ℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)18 h。低溫離心收集菌細(xì)胞，低糖DMEM培養(yǎng)液重懸將其濃度調(diào)整至1 個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?108個(gè)孢子/ml) 。

1.2.5 構(gòu)建白念株菌侵入的組織口腔上皮的體外模型 KB細(xì)胞換液，向Transwell下室加入600 μl DMEM培養(yǎng)液，取20 μl白色念珠菌懸液滴加至組織工程口腔黏膜上皮表面，37 ℃ 5%CO2條件下分別培養(yǎng)8、24和48 h。

1.2.6 過(guò)碘酸雪夫(PAS) 染色 口腔黏膜上皮體外模型經(jīng)4%甲醛固定、浸蠟、石蠟包埋、切片和PAS試劑盒染色，顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 口腔黏膜上皮體外模型

KB細(xì)胞在膠原凝膠中孵育24 h后，得到結(jié)構(gòu)良好的口腔黏膜上皮體外模型。正常對(duì)照的KB細(xì)胞成多角形，貼壁生長(zhǎng)；同時(shí)期培養(yǎng)的口腔黏膜上皮體外模型，從培養(yǎng)初始到培養(yǎng)后48 h，上皮結(jié)構(gòu)、形態(tài)無(wú)明顯變化，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，口腔黏膜上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞間隙變小(圖 1)。

2.2 白念株菌侵入的口腔黏膜上皮體外模型

白色念珠菌加入后8 h，PAS染色見(jiàn)口腔黏膜上皮連續(xù)，結(jié)構(gòu)完整；白色念珠菌呈深紫色，成簇黏附于口腔黏膜上皮表面，形成分散的大小不 一的圓形孢子，輪廓清晰，無(wú)菌絲形成。白色念珠菌加入后24 h，口腔黏膜上皮連續(xù)性不完整；局部有少許菌絲侵入上皮淺部，孢子相白念珠菌明顯多于菌絲相 。白色念珠菌加入后48 h，口腔黏膜上皮進(jìn)一步遭到損害，上皮松解，可見(jiàn)大量菌絲成輻射樣分布、侵入上皮，且菌絲相白念珠菌明顯多于孢子相 。上皮被大量菌絲代替，僅剩少許細(xì)胞殘骸(圖 2)。

圖 1 口腔黏膜上皮體外模型的顯微鏡下影像(×400)

3 討 論

白色念珠菌可侵犯黏膜、皮膚、組織、器官等引起不同程度的白色念珠菌病。黏膜上皮是口腔防御系統(tǒng)的第一道屏障，也是白色念珠菌侵襲的主要部位[9]。

研究表明，為了躲避唾液的沖刷、食物的摩擦以及宿主的免疫，白色念珠菌通過(guò)黏附、定植和侵入的過(guò)程，感染宿主細(xì)胞。研究顯示白色念珠菌可分泌天門(mén)冬氨酸蛋白酶，降解宿主組織屏障，破壞宿主防御分子，并消化宿主蛋白作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[10]。目前對(duì)于白色念珠菌的黏附、破壞作用都有相應(yīng)的研究，但是對(duì)于白色念珠菌侵入組織細(xì)胞的機(jī)制研究較少[7]。

圖 2 白色念珠菌感染侵入口腔黏膜上皮模型(PAS, ×400)

Jabaji等[11]和Li等[12]分別成功地利用膠原凝膠構(gòu)建小腸上皮模型。Almela等[13]利用鼠尾進(jìn)行分離、純化，獲得膠原凝膠，結(jié)合作為支架的磷酸羥基磷灰石/磷酸三鈣和3 種組織細(xì)胞建成骨—口腔粘膜復(fù)合模型，耗時(shí)3 個(gè)多月，更接近真實(shí)口腔黏膜上皮。Hernandez等[14]報(bào)道利用鼠尾取得膠原凝膠，然后單層口腔上皮細(xì)胞系(TR146細(xì)胞系)生長(zhǎng)在膠原凝膠上建立口腔粘膜模型。這些研究證實(shí)了膠原凝膠構(gòu)建的上皮基底對(duì)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的影響，而且膠原凝膠結(jié)合單層上皮細(xì)胞構(gòu)建的上皮模型可以模擬人類黏膜上皮的狀態(tài)。

本研究構(gòu)建口腔黏膜上皮體外模型，再以白色念珠菌對(duì)其進(jìn)行感染，初步建立白色念珠菌侵入的口腔黏膜上皮體外模型。白色念珠菌有芽生孢子和假菌絲兩種存在形式，即菌絲相和孢子相，假菌絲是孢子大量繁殖的致病形式[9,15]。本研究結(jié)果表明，隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)漸旺盛，上皮層逐漸被菌絲代替?？梢?jiàn)大量菌絲成輻射樣分布，且菌絲相白念珠菌明顯多于孢子相 。提示白色念珠菌毒力增強(qiáng)，上皮結(jié)構(gòu)破壞更趨明顯，上皮被大量菌絲代替，僅剩少許細(xì)胞殘骸。

Jayatilake等[16]利用口腔上皮細(xì)胞來(lái)源的TR146細(xì)胞構(gòu)建人多層細(xì)胞的口腔上皮模型，可以較好地觀察白色念珠菌與宿主細(xì)胞的相互關(guān)系。與其他作者[6-7,16]報(bào)道的復(fù)雜模型相比較，本研究直接利用成品凝膠溶液，將其在支持膜上膠化，然后將膠原凝膠作為上皮細(xì)胞的支持表面，使其能更簡(jiǎn)潔、直觀、詳細(xì)地觀察白色念珠菌侵入的過(guò)程。根據(jù)細(xì)胞類型不同，通常上皮細(xì)胞接種膠原凝膠數(shù)天后，上皮模型即可用于進(jìn)一步研究。同樣上皮模型后期可以嵌入其他類型細(xì)胞以完成更復(fù)雜的上皮模型。為了研究粘膜表面細(xì)菌定植的影響，在感染白色念珠菌期間，也可以將來(lái)自正常人的菌群細(xì)菌添加到該模型中。

總之，白色念珠菌侵入的口腔黏膜上皮模型的成功構(gòu)建，使動(dòng)態(tài)觀察白色念珠菌侵入上皮的過(guò)程成為可能；而且口腔黏膜上皮體外模型更接近人體結(jié)構(gòu)，具有可重復(fù)性，對(duì)于開(kāi)展白色念珠菌侵入宿主細(xì)胞后的致病機(jī)理研究具有重要意義。