鄭立娟 湯晨 趙旭

慢性根尖周炎是口腔臨床常見疾病，根管治療為較重要的方法，但對于有些慢性根尖周炎所引起的大面積根尖骨質(zhì)的吸收，除根尖外科手術外尚缺乏有效的方法，而且骨質(zhì)吸收后自行愈合的時間較長，為進一步的修復工作帶來很多問題[1]。根尖骨吸收的機制尚不清楚，其修復方法，有自體骨移植、異體骨移植、骨移植替代材料等。近年來，藥物抑制根尖炎骨吸收為根尖炎的骨質(zhì)修復開辟了一條新途徑。

1999 年Mundy[2]首先提出他汀類藥物具有促進骨質(zhì)生成的作用。辛伐他汀是HMG-CoA的抑制劑,能降低血液中的膽固醇水平，對動脈粥樣硬化具有防治作用[3]。后被證明能夠誘導骨密度的增加，可刺激成骨細胞的分化和成熟，以及骨形成相關基質(zhì)的生成的作用，從而有明顯促進成骨細胞的生成和抑制骨吸收的雙重作用。

關于辛伐他汀促進成骨的實驗研究，大多集中在對于體外培養(yǎng)的成骨細胞的影響[4]，近年來將辛伐他汀用于體內(nèi)骨組織，主要有辛伐他汀對于骨質(zhì)疏松大鼠模型的成骨作用的影響，可能有保護骨質(zhì)疏松的作用，但在口腔醫(yī)學中的相關研究，主要在種植體，正畸領域以及牙周組織改建方面，用于根尖骨國內(nèi)未見文獻報道，國外只有少數(shù)研究他汀類藥物的抗骨吸收活動[5],本課題通過實驗研究論證辛伐他汀用于抑制根尖炎骨質(zhì)吸收和促進成骨的作用，為他汀類藥物用于治療伴骨吸收慢性根尖周炎骨修復提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡SPF級SD大鼠32 只，雄性，體重(200±20) g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要材料及儀器 大腸桿菌標準內(nèi)毒素(湛江安度斯生物有限公司)；辛伐他汀原料藥(紐拜爾醫(yī)藥科技有限公司)；兔抗鼠BMP2多克隆抗體、DAB顯色試劑盒(博奧森生物技術有限公司)；低溫高速離心機(nohbimpex technologies Co.ltd,iFuge,HCT,德國)、全自動生化分析儀(迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司，CS-6400);恒溫水浴箱(上?；|試驗儀器有限公司，DK-S28)、掃描電子顯微鏡(Olympus公司，F(xiàn)V3000,日本)；直接數(shù)字化X線成像系統(tǒng)RVG(SOREDX，DIGORA，Optime,芬蘭)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠慢性根尖周炎骨吸收動物模型 將32 只大鼠隨機分成4組，分為A組(正常對照組)8 只、B組(模型觀察組)8 只，C組16 只，取B組和C組共24 只大鼠，首先將大鼠稱重，用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，仰臥固定上下頜，第一磨牙開髓，置內(nèi)毒棉球并壓緊，動物清醒后，正常飼養(yǎng)。取B組大鼠，于開髓后的第2周末和第3周末分別處死4 只，分離上下頜骨，取牙頜骨聯(lián)合標本，置于4%的甲醛溶液中固定待用。

1.2.2 建立大鼠辛伐他汀用藥模型 于建模手術3 周末根尖炎模型建立成功時，取C2組(辛伐他汀組)大鼠，分別稱重，按照20 mg/kg/d劑量的辛伐他汀配成1 ml的溶液灌胃，于第3周末開始，每天1 次，持續(xù)2 周。C1組(生理鹽水組)每天給予等量生理鹽水灌胃，喂藥2 周后取A組，C1和C2組于心尖處穿刺取血，至于紫色采血管中靜置，離心后取上清液，自動生化分析儀測量血清ALP、Ca、P，處死C1組和C2組，分離上下頜骨組織，取牙頜骨聯(lián)合標本，置于4%的甲醛溶液中固定，分別用RVG成像系統(tǒng)拍攝X線片[6]。

1.2.3 制作組織病理學切片并進行HE染色 按步驟進行二步法免疫組織化學染色，在光學顯微鏡下觀察，隨機選取2 個視野，記錄陽性表達細胞計數(shù)，計算陽性表達率并攝像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 實驗性根尖周炎骨吸收X線影像分析

術后2 周末，大鼠根尖周組織開始出現(xiàn)低密度的陰影；3 周末時，陰影面積明顯增大，此時為根尖周炎癥的高峰期?？梢姡庵荜幱懊娣e的增寬隨著根尖周炎癥的不斷進展而逐漸變大，疾病發(fā)展階段，根尖陰影面積與時間成正比關系。而至5 周末時炎癥吸收趨于穩(wěn)定，轉(zhuǎn)為慢性，用藥灌胃2 周后，生理鹽水組大鼠根尖骨吸收陰影面積未見明顯改變，辛伐他汀組大鼠根尖骨吸收陰影面積減小，有明顯愈合趨勢(圖 1)。

圖 1 各組大鼠上下頜第一磨牙根尖X線片

2.2 血清骨形成相關生化指標的測定

由表 1可見，血清鈣在各組間比較：按顯著性為0.05的水平，C1組與A組比較P=0.040，C2組與A組比較P=0.023，C2組與C1組比較P=0.795。

表 1 給藥前后血清Ca、P、ALP濃度的變化

注： ① 與A組比較，P<0.05； ② 與C1組比較，P>0.05； ③ 與A組比較，P>0.05； ④ 與C1組比較，P<0.05

血清磷在各組間比較：C1組與A組比較P=0.026，C2組與A組比較P=0.515，C2組與C1組比較P=0.316。

ALP在各組間比較：C1組與A組比較差異有顯著性(P=0.000)，C2組與A組比較P=0.172，C2組與C1組比較P=0.020。

2.3 實驗性根尖周炎組織病理學分析

用雙目光學顯微鏡用×100倍數(shù)觀察組織病理切片，隨機選取2 個視野，觀察炎癥狀態(tài)。

實驗結果顯示，術后2 周末，牙髓組織中可見大量炎癥細胞浸潤區(qū)域并有局部或大部分牙髓壞死，牙周膜間隙可見增寬，根尖周組織開始出現(xiàn)炎癥及根尖周牙槽骨開始出現(xiàn)破壞；3 周末時，炎性細胞浸潤明顯加重，根尖周炎癥及牙槽骨破壞明顯加重；至第5周末時， 表現(xiàn)為慢性炎癥，根尖周骨組織破壞不再加重，周圍有纖維組織包繞，局部牙骨質(zhì)可見增生，而C2組根尖牙骨質(zhì)及根尖骨增生明顯，骨修復現(xiàn)象明顯(圖 2)。

組織病理學切片按照統(tǒng)一的標準和盲法的原則進行評估。

2.4 BMP2免疫組織化學染色結果分析

BMP2陽性產(chǎn)物定位于細胞核，呈棕黃色， C2組(辛伐他汀組)陽性染色出現(xiàn)于骨細胞、成骨細胞及部分間充質(zhì)細胞,陽性著色深且廣泛， C1組(生理鹽水組)陽性染色出現(xiàn)于骨基質(zhì)表面及骨小梁周圍的部分骨細胞、成骨細胞,陽性著色減少；A組(正常對照組)陽性染色少，分散淡染，用Image pro-plus圖像分析軟件分別計算陽性率(含棕黃色顆粒細胞)并取平均值。A、C1和C2組陽性率分別為(25.0±2.7)%、(45.0±3.2)%和(62.0±5.1)%。C1與C2組分別與A組相比(P=0.000)；C2組與C1組比較(P=0.000)，辛伐他汀組大鼠BMP2陽性表達率明顯升高(圖 3)。

圖 2 大鼠根尖周炎組織學觀察 (HE, ×100)

圖 3 BMP2在各組大鼠根尖周炎癥組織中的表達 (×400)

3 討 論

慢性根尖周炎主要的病理表現(xiàn)為炎性肉芽組織和牙槽骨破壞。臨床上對于根尖周炎的治療，根管治療常常獲得較好的療效，但是慢性根尖周炎伴有大面積的骨吸收也較常見，除了根管治療同時需進行根尖外科手術。這類疾病骨吸收面積大，自行愈合時間較長，為修復工作帶來難題，臨床上對于慢性根尖周炎導致骨吸收的治療和促進骨質(zhì)的愈合在不斷探索中。

建立根尖周病的動物模型是研究根尖周病發(fā)病機制的重要手段，以此來觀察炎癥浸潤的范圍和程度、骨吸收的面積以及各種不同因子在根尖周炎中的表達[7]。也可施加一些干預因素(如藥物、激素等)，來觀察這些因素對根尖周病的影響。本實驗采用內(nèi)毒素棉球置于髓腔中并開放于口腔自然環(huán)境中，這種方法既可使內(nèi)毒素發(fā)揮快速有效的致炎作用，又可使口腔中的混合菌感染牙髓，細菌內(nèi)毒素(LPS)[8]主要成分為LPS，LPS為炎性刺激物，能夠使機體產(chǎn)生一系列的炎癥反應和免疫反應，進一步造成病理性損傷，導致骨質(zhì)吸收等[9]。本實驗兩周末，3 周末大鼠均可見明顯地觀察到根尖骨吸收陰影，根尖區(qū)牙周膜及硬組織隨著根尖炎癥的不斷進展而出現(xiàn)骨質(zhì)的吸收破壞，且3 周末陰影面積較兩周末明顯增大，大鼠根尖周炎模型建模成功，隨后炎癥吸收趨于穩(wěn)定，并出現(xiàn)增生修復現(xiàn)象。此種方法可以在周期較短的過程中觀察根尖炎的發(fā)展和致病機制，這樣得到的動物模型與文獻報道的其他方法比較，其病變發(fā)病較快，周期短，方便快捷且接近于根尖周炎的自然發(fā)病過程[10-11]。

他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，辛伐他汀為他汀類藥物常用的一種，廣泛應用于降低血膽固醇及低密度脂蛋白的水平，可起到預防動脈粥樣硬化、降低心血管疾病的發(fā)生率的作用。以往研究證實辛伐他汀可影響骨代謝，具有使骨量增加，使骨密度值提高，促進骨形成相關基因的表達。本研究通過口服給藥來研究辛伐他汀對于根尖骨組織骨代謝的影響。

血清總堿性磷酸酶 (ALP)是評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換的常用指標。ALP與骨礦化過程密切相關，因為堿性的環(huán)境有利于骨鈣化的過程，使其更為活躍，成骨細胞能夠釋放ALP，所以堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期指標之一，其表達隨著成骨細胞的發(fā)展而加強，代表骨形成的狀況，本實驗中，C2組(辛伐他汀組)在給藥2周后，通過大鼠血清檢測發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶濃度較對照組明顯升高，表明成骨細胞處于活躍狀態(tài)，接近正常對照組，這說明辛伐他汀可明顯刺激成骨細胞的增殖和分化，有明顯促進骨形成的作用。與沈蘭花等[12]采用MTT法、二辛可寧酸法檢測辛伐他汀可促進堿性磷酸酶的活性的研究結果相一致。

在以往大鼠實驗研究中，他汀類藥物可以局部誘導成骨，加快骨修復。通過一系列的分子最終作用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2),使成骨細胞內(nèi)BMP2基因表達的增強[13]。

他汀類藥物可以通過多條通路、多個連鎖環(huán)節(jié)最終促進BMP2的表達和活性。他汀類藥物可以通過以下信號通路促進BMP2表達：如辛伐他汀可以使Smad1和Smad5信號蛋白的表達水平明顯增加；還可作用于小GTP-包含蛋白，使eNOS表達增加，增強BMP2的活性；也可通過PI3 K/Akt相關信號通路，增加內(nèi)皮細胞eNOS-mRNA的穩(wěn)定性,使eNOS的活性增強，具有使BMP2的表達上調(diào)的作用[14]；還可以抑制Rho和Rho激酶的活性，從而導致BMP2的表達上調(diào)。還存在一些交叉，如促分裂素原活化蛋白激酶，MAPK信號傳導途徑和Wnt信號通路[15-16]，辛伐他汀作用于根尖骨修復的分子機制有待進一步研究。

而BMP2是對于骨形成和骨修復具有極強的促進作用的蛋白，它不僅可以促進成骨細胞及其相關前體細胞的增殖，并且具有促進成骨細胞分化的作用，同時具有促進相關間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞，還可誘導具有多種分化潛能的成纖維細胞間質(zhì)前體細胞轉(zhuǎn)化為成熟的成軟骨細胞和成骨細胞，誘導間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為具有成骨作用能力的細胞，進而發(fā)揮成骨細胞強大的成骨作用，增加骨量，修復骨質(zhì)的微損傷，防治骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[17]。同時有文獻報道[18]，BMP2可以有效地增加ALP的活性，如前文所述，ALP活性增強，成骨作用增強。本實驗在大鼠根尖炎骨吸收動物模型建模成功后，給予辛伐他汀溶液20 mg/kg/d灌服2 周后，取牙頜骨聯(lián)合標本制作病理切片后進行免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)實驗組根尖牙槽骨成骨細胞內(nèi)可見明顯的陽性染色，而對照組僅有少量表達，實驗組陽性染色率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。

本實驗論證了口服辛伐他汀對于根尖炎骨組織的修復有一定的促進作用。為藥物輔助治療根尖炎骨吸收提供了新的思路。臨床上治療慢性根尖周炎骨吸收目前主要采用根管治療，必要時配合根尖手術，但有時慢性根尖周炎伴有大面積骨吸收不易愈合或愈合時間較長，為進一步的修復工作帶來難題，因觀察愈合周期較長，易有牙折及冠部滲漏的可能，影響根管治療的療效；若在根尖病灶不愈合進行早期冠修復，則存在一定的風險。所以用藥物輔助治療來促進骨吸收的愈合，可解決以上難題。關于辛伐他汀促進根尖炎骨質(zhì)的修復的分子機制、作用機理、劑型以及給藥方式等還有待于進一步探索。