馮 婷， 張 凡， 殷云龍， 韓正敏， 華建峰， 於朝廣

(1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014； 2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210037)

落羽杉屬(TaxodiumRich.)屬于杉科(Taxodiaceae)，屬內(nèi)主要分3個種，落羽杉[Taxodiumdistichum(Linn.)Rich.]、池杉(T.ascendensBrongn.)和墨西哥落羽杉(T.mucronatumTenore)[1-2]。中山杉(Taxodium‘Zhongshanshan’)主要是落羽杉、墨西哥落羽杉、池杉3個樹種種間雜交得到的優(yōu)良無性系的總稱[3]，因其兼具生長快、耐鹽堿、耐水淹、成材率好、常綠性優(yōu)、觀賞價值高等落羽杉屬樹種的優(yōu)點，現(xiàn)成為我國南方低洼濕地造林的優(yōu)選樹種[4-6]。然而，近年來隨著種植面積的擴大，赤枯病害問題也日益突顯。

赤枯病是杉科樹種生長過程中容易發(fā)生的真菌性病害。其中水杉和杉木赤枯病的研究報道較多，水杉赤枯病的病原菌主要為擬盤多毛孢(Pestalotiopsissp.)、鏈格孢(Alternariasp.)和炭疽菌(Colletotrichumsp.)[7-8]。病原菌在水杉表皮組織上以菌絲體越冬，次年3月底至5月上中旬遇上風(fēng)雨產(chǎn)生分生孢子，借助風(fēng)雨傳播侵染。該病先從水杉的中下部枝葉表現(xiàn)發(fā)病，逐漸向上擴展蔓延，嚴重發(fā)生時導(dǎo)致全株枯死。感病葉逐漸呈深褐色，生有灰黑色的絨狀小點，并易脫落。高溫濕度大的條件下有利于它的侵染蔓延[9]。研究表明，水杉赤枯病的防治主要選用80%多菌靈、72%甲基硫菌磷、25%三唑酮等農(nóng)藥單使用或混合使用，按600倍液噴霧，一般可以達到85%以上的防治效果[9]。杉木赤枯病病原菌主要為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)、黑盤孢目多毛孢屬(Pestalotiasp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)。杉木赤枯病病菌以孢子和菌絲體在病葉組織中隨枯死針葉落在土中越冬，翌年夏季產(chǎn)生分生孢子借風(fēng)傳播[10]。6—8月中旬發(fā)病，7月為發(fā)病盛期，此時苗木進入初生長，較嫩弱，因此極易受害。該病蔓延迅速，2 d之內(nèi)即暴發(fā)成災(zāi)，發(fā)病初期，病原菌首先侵害幼苗頂梢的嫩葉，致使葉尖部出現(xiàn)淡褐色病斑，并很快向下部蔓延，之后迅速擴展到整個頂梢造成頂部枯死，被嚴重侵害的杉木苗很快出現(xiàn)成片或成塊壞死[11]。另有研究表明，在杉木赤枯病的防治中，應(yīng)用多菌靈或退菌特加尿素(0.5%)加磷酸二氫鉀(0.5%)進行交替葉面噴霧，且每隔10 d噴霧1次，連續(xù)作業(yè)，可有效預(yù)防赤枯病的發(fā)生[12]。

對南京中山植物園及周邊地區(qū)的落羽杉屬樹木葉部的發(fā)病情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病來勢迅猛，由樹下到樹上、樹冠外緣向內(nèi)膛、復(fù)葉基部向頂端發(fā)展，多則10 d，少則1周，就可造成2/3葉片變黃，然后脫落。發(fā)病時病葉出現(xiàn)褐色小斑點，后擴大變?yōu)榘岛稚鲇瓿睗駮r病斑上產(chǎn)生許多突起的黑色小霉點，癥狀與水杉和杉木赤枯病癥狀較類似。然而目前對落羽杉屬赤枯病的發(fā)生規(guī)律及防治方法尚無研究報道。隨著落羽杉屬樹木種植范圍的不斷擴大[13-14]，赤枯病病害對該屬樹種的推廣應(yīng)用及經(jīng)濟效益造成了嚴重影響。因此，探究落羽杉屬樹木赤枯病的侵染方式和發(fā)病規(guī)律可為該病的有效防治提供理論指導(dǎo)，而殺菌劑的室內(nèi)測定可為快速地篩選出安全高效的農(nóng)藥品種及制定有效的防治策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及病癥分級標準

選取南京中山植物園苗圃內(nèi)的落羽杉、墨西哥落羽杉、中山杉118[(落羽杉×墨西哥落羽杉)×墨西哥落羽杉]、中山杉405(墨西哥落羽杉×落羽杉)、中山杉406(墨西哥落羽杉×落羽杉)、中山杉407(墨西哥落羽杉×落羽杉)和中山杉502(墨西哥落羽杉×落羽杉)進行調(diào)查研究。調(diào)查從4月份落羽杉抽葉后開始，并將落羽杉屬樹木對赤枯病的發(fā)病程度分為5級(代表值分別為1～5)：針葉正常、無發(fā)病的為1級；病葉占總?cè)~數(shù)的1/4及以下的為2級；病葉占總?cè)~數(shù)的 1/4 以上且1/2及以下的為3級；病葉占總?cè)~數(shù)的1/2及以上且3/4以下的為4級；病葉占總?cè)~數(shù)的3/4及以上的為5級。感病指數(shù)=∑(各級株數(shù)×代表值)×100%/(總株數(shù)×最高級代表級)。

1.2 病原菌越冬方式及傳播方式

病原菌越冬方式：在南京中山植物園苗圃采集落羽杉屬病樹上的芽、枝、梢、病葉和林下表土進行分離培養(yǎng)。統(tǒng)計分離結(jié)果，分析病原菌的越冬方式及越冬場所[15]。從落羽杉屬樹木上采摘新芽、小枝、梢和病葉各60個，將上述材料剪成小塊，投入盛有適當蒸餾水的三角瓶中；取樹周表土5 g，放入盛有適當蒸餾水的三角瓶中；將上述盛有待測樣品的三角瓶置于振蕩儀上，充分振蕩后，濾去芽、碎片或雜質(zhì)，制成清洗液；清洗液經(jīng)離心后，留下5 mL，鏡檢，每次取0.1 mL，滴在載玻片上，觀察有無病原菌的分生孢子存在，重復(fù)檢查3次[16-17]。孢子傳播方式的調(diào)查：從發(fā)病的落羽杉林內(nèi)選擇6棵標準株，在每個植株東、南、西、北4個方向分別掛上涂有薄薄一層凡士林的玻片來捕捉分生孢子。玻片隔日換回，在顯微鏡下對每個玻片隨機鏡檢觀測5個視野，統(tǒng)計捕捉到的分生孢子數(shù)量，記錄孢子的飛散日期、孢子的飛散量和天氣情況，以確定分生孢子的傳播方式[18]。

1.3 落羽杉赤枯病病原菌的殺菌劑篩選

藥劑：代森錳鋅，有效成分為乙撐-1，2-雙二硫代氨基甲酰錳和鋅的絡(luò)鹽，70%可濕性粉劑(四川國光農(nóng)化股份有限公司)；甲基硫菌靈，70%可濕性粉劑(江蘇龍燈化學(xué)股份有限公司)；多菌靈，50%可濕性粉劑(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)；國光黑殺，有效成分為烯唑醇，12.5%可濕性粉劑(四川國光農(nóng)化股份有限公司)；苯甲丙環(huán)唑，有效成分為苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑，30%乳油(青島瀚生生物科技股份有限公司)；井岡蛇床素，有效成分為井岡霉素、蛇床子素，6%可濕性粉劑(溧陽中南化工有限公司)；波爾多液，80%可濕性粉劑(美國仙農(nóng)股份有限公司)；福美雙，有效成分為12.5%福美甲胂、25.0%福美雙、12.5%福美鋅，50%可溶性粉劑(天津市興果農(nóng)藥廠)。室內(nèi)藥效測試：將供試農(nóng)藥用無菌水分別配成4個濃度梯度(6、10、60、300 mg/L)的溶液，分別加入含有相同量的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡稱PDA)培養(yǎng)基中，每個濃度梯度設(shè)置3個重復(fù)并且設(shè)置空白對照；然后將直徑為 0.5 cm 的供試菌落移植于培養(yǎng)基中間，置于25 ℃條件下培養(yǎng)4 d，測量其菌落直徑，并計算菌落擴展抑制率。菌絲生長速率測定：在以上室內(nèi)藥效測試的基礎(chǔ)上進一步對篩選出的4種農(nóng)藥分別設(shè)置9個濃度梯度(50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、2.50、0.50、0.10、0.01 mg/L)，進行毒力測定后計算并比較半數(shù)有效濃度(effective concentration 50%，簡稱EC50)[19]。

室內(nèi)生物測定計算方法與數(shù)據(jù)處理：采用“十”字交叉法測量菌落直徑，菌落擴展相對抑制率=(對照菌落生長凈直徑-處理菌落生長凈直徑)×100%/對照菌落生長凈直徑[20]。初篩后的藥劑既用于測定菌落擴展相對抑制率也用于測定濃度對數(shù)(X)與抑制菌落生長百分率的機率值(Y)，利用最小二乘法分別求得各殺菌劑對該菌的毒力回歸方程Y=a+bX和EC50。然后在初篩藥劑的EC50下進行孢子萌發(fā)測試并計算孢子萌發(fā)抑制百分率。孢子萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子數(shù)×100%/總孢子數(shù)。孢子萌發(fā)抑制率=(對照孢子萌發(fā)率-藥劑處理孢子萌發(fā)率)×100%/對照孢子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 落羽杉赤枯病的發(fā)病規(guī)律

2.1.1 病原菌越冬及孢子的釋放規(guī)律 前期筆者所在實驗室通過柯赫氏法則對引起落羽杉屬樹木赤枯病的病原菌進行了分離鑒定，并利用分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)方法，初步確認致病病原菌為斑污擬盤多毛孢(Pestalotiopsismaculans)。為了確認致病病原菌的越冬方式，從易感病的中山杉405種植土壤中及樹木不同部位上分離出病原菌并檢查了病原菌菌絲和分生孢子。結(jié)果顯示，病原菌可在病葉、小枝、梢部和芽中越冬，其中以病葉上的帶菌率(96.7%)最高，小枝(76.7%)次之，而梢和芽的帶菌率分別為46.7%、31.6%，土壤最低，為0%。因此，認為病葉組織和小枝可能是病原菌的主要越冬場所。此外，對雜交落羽杉405病葉組織和小枝的洗液進行鏡檢，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)分生孢子，推測該病原菌不是以孢子而是以菌絲形態(tài)越冬。

2.1.2 病原菌的傳播方式 從5月初到7月末，每隔1 d記錄1次孢子捕捉數(shù)量及當天的環(huán)境因子(溫度、濕度、降水量和風(fēng)速)。結(jié)果表明，病原菌分生孢子5月開始飛散，6月中旬達到飛散最高峰，7月底漸止。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，孢子飛散與溫度的相關(guān)系數(shù)，即r值最大，為0.617，其次是平均濕度(r值為 0.543)，之后是降水量(r值為0.297)、平均風(fēng)速(r值為 0.257)。因此，推斷孢子飛散的最主要影響因子是溫度，其次是濕度、降水量和風(fēng)速。

2.2 不同落羽杉屬樹種的抗病性差異

對不同月份落羽杉、墨西哥落羽杉和它們的雜交無性系品種的感病情況進行調(diào)查。結(jié)果表明，墨西哥落羽杉、中山杉405、中山杉407、中山杉502和中山杉118均為感病品種，而落羽杉、中山杉406為抗病品種。由圖1可知，墨西哥落羽杉發(fā)病最早，7月開始發(fā)病，其次是中山杉407在8月開始發(fā)病，中山杉405、中山杉502、中山杉118從9月開始發(fā)病。墨西哥落羽杉發(fā)病早，且感病較重，感病指數(shù)范圍為43.7%～96.3%，且感病指數(shù)在8—9月期間變化最為明顯，因此8—9月為墨西哥落羽杉赤枯病感病最為嚴重的時期。中山杉405雖發(fā)病較遲，9月才開始發(fā)病，但病情蔓延較快，感病指數(shù)范圍為53.3%～96.7%，11—12月，整樹枯黃，病葉掉落嚴重。中山杉407、中山杉502、中山杉118病情較墨西哥落羽杉及中山杉405輕，感病指數(shù)范圍分別為42.8%～83.1%、41.3%～84.8%、59.6%～86.7%，病勢的蔓延較慢。落羽杉、中山杉406不發(fā)病。

2.3 落羽杉赤枯病防治技術(shù)研究

2.3.1 供試殺菌劑的初篩結(jié)果 對比參試的8種殺菌劑對落羽杉赤枯病病原菌的抑制效果。由圖2可知，從最大抑制率來看，多菌靈、甲基硫菌磷、蛇床素、苯甲丙環(huán)唑、代森錳鋅、國光黑殺、福美雙、波爾多液對病原菌菌絲的抑制作用依次降低。多菌靈和甲基硫菌磷的最大抑制率達到100%，且多菌靈在各個濃度下對供試菌株的菌落抑制率均達到100%。甲基硫菌磷在較低濃度時對供試菌株的菌落抑制率較低，隨著濃度的增加抑制率也隨之升高，各濃度間抑制率相差較大，最高達到100%。蛇床素和苯甲丙環(huán)唑的最大菌落抑制率也較高，分別達到88.5%、84.6%。蛇床素在較低濃度時已表現(xiàn)出60.3%的抑制率，隨著其濃度的增大，抑制率上升到88.5%。苯甲丙環(huán)唑與蛇床素相似，但抑制率在同等濃度時均低于蛇床素。代森錳鋅、國光黑殺、福美雙、波爾多液的最大菌落抑制率依次為52.7%、40.8%、26.8%、5.1%。其中代森錳鋅、福美雙隨著濃度的增加，抑制率相對提高。在一定濃度范圍內(nèi)國光黑殺對菌株的菌落抑制率不與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。其中波爾多液在6、10、60 mg/L時出現(xiàn)了負抑制作用，即在此濃度下波爾多液對斑污擬盤多毛孢的生長有促進作用，只有在濃度為300 mg/L時才對斑污擬盤多毛孢的生長具有抑制作用。結(jié)果表明，多菌靈、甲基硫菌磷、蛇床素和苯甲丙環(huán)唑的最大菌落抑制率都在80%以上，因此，選取這4種殺菌劑進行下一步試驗。

2.3.2 初篩藥劑對病原菌菌絲的影響 如圖3所示，4種殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用均整體隨著藥劑濃度的增加而增強。多菌靈在濃度為2.50 mg/L時抑制率已達100%，在濃度較低時亦表現(xiàn)抑菌效果。甲基硫菌磷在較高濃度時具有良好的抑制菌絲生長的作用。蛇床素與苯甲丙環(huán)唑情況類似，但在較低濃度(0.01～2.50 mg/L)時，在同等濃度下苯甲丙環(huán)唑抑制率整體優(yōu)于蛇床素。此外，分析4種藥劑的EC50時發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌磷的EC50最高，為24.283 mg/L，即它對病原菌株斑污擬盤多毛孢毒力最低；其次為苯甲丙環(huán)唑，其EC50為 14.320 mg/L；多菌靈的EC50最低，為1.051 mg/L，說明它對病原菌株的生長抑制作用最強，而蛇床素對斑污擬盤多毛孢的毒力也較高，生長抑制作用較強，其EC50為4.356 mg/L(表1)。

2.3.3 初篩藥劑對孢子萌發(fā)的影響 表1結(jié)果表明，多菌靈、甲基硫菌磷、蛇床素、苯甲丙環(huán)唑這4種農(nóng)藥的濃度分別為1.051、24.283、4.356、14.320 mg/L時，對病原菌孢子處理12 h后的孢子萌發(fā)抑制率分別為49.4%、53.6%、32.4%、61.8%，其中空白對照的孢子萌發(fā)率為86.3%。試驗表明，4種藥劑不但對斑污擬盤多毛孢菌絲有較高的抑制作用，對孢子萌發(fā)也有較好的抑制作用。在各自的EC50條件下，苯甲丙環(huán)唑?qū)Σ≡咦用劝l(fā)的抑制作用最強，其次是甲基硫菌磷和多菌靈，蛇床素對病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用最弱，抑制率為32.4%。從菌絲生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率綜合來評定，多菌靈對病原菌的抑制作用最強。

表1 4種殺菌劑對病原菌孢子萌發(fā)的影響

3 結(jié)論與討論

落羽杉屬樹種赤枯病7月下旬開始發(fā)病。在1個生長季節(jié)中，赤枯病的發(fā)生只有1次高峰，時間為8—9月。病原菌主要以菌絲在小枝和落葉組織中越冬，但2種組織中越冬菌的數(shù)量差別很大，小枝中較少，落葉病組織中較多。孢子從5月開始飛散，6月中旬捕捉的孢子最多，7月下旬停止，并且溫度對其影響較大。因此，在病害暴發(fā)前，尤其是高溫高濕時要加大對落羽杉屬樹木赤枯病的防治力度。另外，在不同落羽杉屬樹種中，墨西哥落羽杉易染病，而落羽杉則較抗病，兩者的雜交后代中山杉405易染病、中山杉118和中山杉407次之，中山杉502染病程度輕，而中山杉406則較抗病。本研究發(fā)現(xiàn)，落羽杉和墨西哥落羽杉對赤枯病病害的抗性存在較大差異，其雜交子代對赤枯病害的表現(xiàn)也不盡相同，這為今后選育出具有更抗病的中山杉品種奠定了理論基礎(chǔ)。

對落羽杉赤枯病致病病原菌的室內(nèi)殺菌劑進行篩選，得到4種高效殺菌劑：多菌靈、甲基硫菌磷、蛇床素、苯甲丙環(huán)唑，它們的EC50分別為1.051、24.283、4.356、14.320 mg/L，對病原菌斑污擬盤多毛孢的孢子萌發(fā)抑制率分別為49.4%、53.6%、32.4%、61.8%。多菌靈為內(nèi)吸性治療菌劑，長期單一使用易引起病原菌的抗藥性，因此須要進行殺菌劑輪換使用或混合使用。由于蛇床素提煉成本較高，單劑使用不經(jīng)濟、難以推廣，可以考慮將蛇床素與農(nóng)用抗生素井岡霉素進行復(fù)配使用。多菌靈、甲基硫菌磷[21-22]也可用于土壤處理，且這些藥劑在市場上價格適中，容易購買。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，不同殺菌劑對斑污擬盤多毛孢的菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制效果不同，這為進一步在大田中通過優(yōu)化殺菌劑的配比方案得到更好的抑菌效果奠定了基礎(chǔ)。