王學娟

(內(nèi)蒙古民族大學生命科學學院，內(nèi)蒙古通遼 028000)

低溫是影響植物正常生長發(fā)育的重要非生物脅迫之一，不僅限制植物的種植范圍，而且還會造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)的下降[1]。我國大部分地區(qū)位于暖溫帶和亞熱帶，植物對低溫的影響非常敏感，即便是很小的降溫幅度，也會給一些植物造成直接或間接損害[2]。冷害幾乎每年都會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，嚴重時甚至會絕收[3]。低溫脅迫直接抑制植物細胞內(nèi)的新陳代謝和多種生理生化反應，間接引起植物細胞的滲透脅迫、氧化脅迫和其他脅迫，同時低溫能使植物細胞吸水速率降低，嚴重時細胞內(nèi)結(jié)冰導致細胞結(jié)構(gòu)的破壞，這種傷害是不可逆的[4]。我國東北地區(qū)葡萄酒工業(yè)產(chǎn)品發(fā)展緩慢，影響其發(fā)展的主要因素是釀酒的原料不足。東北地區(qū)冬季嚴寒，無霜期較短，有效積溫不足，一些釀酒葡萄品種很難完全成熟，如赤霞珠葡萄等。因此，選育出適應寒帶地區(qū)氣候條件的釀酒葡萄新品種，是我國東北寒帶地區(qū)葡萄酒工業(yè)快速發(fā)展的一個重要前提條件。北冰紅葡萄是國內(nèi)推出的適宜釀酒的葡萄新品種，具有抗寒豐產(chǎn)等特點，不僅適于大面積的生產(chǎn)果實，也是良好的觀賞植物，發(fā)展前景廣闊[5]。但也有研究表明，北冰紅在吉林省吉林市等地區(qū)露地越冬，植株地上部枝蔓仍會發(fā)生凍害，萌芽率僅為21.3%，造成減產(chǎn)[6]，因此提高葡萄的耐寒性具有現(xiàn)實的意義。

COR基因家族參與低溫脅迫的調(diào)節(jié)。Breton等在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)并克隆出COR413基因[7]。目前已報道的家族成員有COR6.6、COR15a、COR47、COR78、COR413等[8-9]。COR413蛋白家族為植物所特有，包括定位于細胞膜上的細胞膜型冷適應蛋白COR413-PM(COR413-plasma membrane proteins)及定位于類囊體膜上的類囊模型冷適應蛋白COR413-TM(COR413-thylakoid membrane proteins)2類具有明顯區(qū)別的蛋白組。研究表明，編碼COR413蛋白的基因家族在擬南芥和谷類等草本植物的抗凍性形成中發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究以耐寒性較強的北冰紅葡萄為材料，利用PCR技術(shù)，獲取北冰紅耐寒基因VvCOR413-I2，并進行分子特征分析，以期為進一步研究VvCOR413-I2基因的轉(zhuǎn)化和功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

選擇山葡萄品種北冰紅為試驗材料，由河北昌黎葡萄種植園提供。大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10，由筆者所在實驗室保存。RNAiso Plus試劑盒、PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase試劑盒、Ex-Taq、pMD-19T Easy Vector，均購自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

采取北冰紅葡萄幼嫩葉片，按照RNAiso Plus試劑盒和PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase試劑盒說明書進行總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。

1.3 COR413-I2基因引物設計及全長克隆

通過https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html檢索葡萄(Vitisvinifera)Genoscope.12X基因組中COR413基因序列，并在NCBI上檢索其他植物COR413基因序列，對葡萄基因組中COR413基因序列進行Blast比對，設計特異性引物。上游引物COR413-I2-F：3′-ATGGGGAAAAAGGGTTACT-TGGCG-5′，下游引物COR413-I2-R：3′-CTATAGGAAGT-GAAGTACCAGAGCC-5′，引物由華大基因合成。

參照TaKaRa公司的Ex-Taq說明書，以cDNA為模板，利用Ex-TaqBuffer，Ex-Taq，dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)和引物COR413-I2-F/COR413-I2-R擴增COR413-I2全長。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、分析、拍照后，回收目的片段，與pMD19-T Easy Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)，將感受態(tài)活化培養(yǎng)，并進行藍白斑篩選，挑取陽性菌進行菌液PCR檢測，選取3個檢測為陽性的菌液送至北京華大中生科技發(fā)展有限公司進行基因測序。

1.4 生物信息學分析

利用DNAMAN、TMHMM、Blast、WOLF PSORT等生物信息學軟件對該序列及其編碼的氨基酸序列進行分子特征分析和結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和檢測

RNA提取電泳結(jié)果(圖1)中可見清晰的3條條帶，分別為5S、18S、28S RNA，純度檢測結(jié)果為D260 nm/D280 nm=2.10，可以進行反轉(zhuǎn)錄。

2.2 COR413-I2基因全長克隆及檢測結(jié)果

以北冰紅葡萄葉片cDNA為模板可以擴增出609 bp大小的基因片段(圖2)，與葡萄基因組中COR413基因大小一致。通過對陽性菌液進行PCR檢測，初步推測目的基因成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中(圖3)。

2.3 VvCOR413-I2基因及氨基酸分子特征分析

通過測序結(jié)果分析，成功克隆出VvCOR413-I2全長(圖4)。該基因編碼202個氨基酸殘基，編碼的蛋白分子量為22.6 ku，等電點值為9.88，pH值為7.0時電荷為6.88。對VvCOR413-I2編碼的氨基酸序列與麻風樹(Jatrophacurcas)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、可可樹(Theobromacacao)、榴蓮(Duriozibethinus)、橡膠(Heveabrasiliensis)等植物的氨基酸序列進行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)同源性在78%以上。其中與橡膠的同源性最高，同源性為85%(圖5)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，VvCOR413-I2蛋白與上述5種植物的COR413-I2具有較近的親緣關系(圖6)。

2.4 COR413-I2蛋白的結(jié)構(gòu)特性

利用NCBI的Conserved Domains功能對COR413-I2蛋白進行分析，結(jié)果顯示，VvCOR413-I2編碼的蛋白含有WCOR413蛋白的功能域(圖7)，屬于WCOR413超家族成員；運用SOPMA軟件對COR413-I2蛋白二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示該蛋白存在81個α螺旋、17個β轉(zhuǎn)角、43個延伸鏈、61個隨機線圈；COR413-I2蛋白含有5個跨膜結(jié)構(gòu)(圖8)。

3 結(jié)論與討論

冷害時常會使植物發(fā)生淀粉轉(zhuǎn)化為糖、二氧化碳交換減少、凈光合速率降低、葉綠素降解等生理機能失調(diào)的現(xiàn)象，從而導致作物減產(chǎn)甚至死亡[11]。COR413蛋白在感應到冷害脅迫信號后，通過維持植物細胞膜的穩(wěn)定性來減少冷害對植物細胞的傷害， 其結(jié)構(gòu)與哺乳動物的視紫質(zhì)類似G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupled receptor，簡稱GPCR)蛋白家族相似[4，12]，但二者機制是否相似或相同有待進一步研究?，F(xiàn)在已有大量研究證明，COR413蛋白家族在植物應對冷脅迫的機制中起著重要的作用，冷脅迫下丹參、針葉福祿考等植物的COR413基因表達量明顯提高[13-14]。COR413基因的異源表達結(jié)果表明，將檉柳的冷適應蛋白基因轉(zhuǎn)入粳稻中，轉(zhuǎn)基因粳稻的耐寒性明顯高于對照組[15]， 轉(zhuǎn)蠟梅COR413基因的煙草同樣表現(xiàn)出較高的耐寒性[16]。轉(zhuǎn)番茄COR413基因的煙草不僅在冷脅迫下正常生長，同時在干旱脅迫時表現(xiàn)出更強的適應能力[17]，表明COR413家族在響應冷脅迫的同時還可以響應干旱脅迫。本研究以耐寒葡萄品種北冰紅葉片為試驗材料，克隆出VvCOR413-I2基因并對該基因進行了特征分析，為分析該基因的功能及通過基因工程手段選育抗寒葡萄新品種奠定基礎。