謝琮琮， 許文武， 李至敏， 王小琴， 雷國(guó)風(fēng)， 張 偉， 黃 婷， 李志敏

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045； 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江西南昌 330045)

藍(lán)藻，別稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，在藻類中是最簡(jiǎn)單、最原始的單細(xì)胞原核生物，也是目前發(fā)現(xiàn)的最早的光合釋氧生物。藍(lán)桿藻ATCC 51142是一種白天進(jìn)行光合作用，夜間通過(guò)固氮作用產(chǎn)氫的固氮型藍(lán)細(xì)菌[1]。由于在藍(lán)藻基因組中沒(méi)有檢測(cè)到α-酮戊二酸脫氫酶基因[2-3]，長(zhǎng)期以來(lái)學(xué)術(shù)界一直認(rèn)為藍(lán)藻沒(méi)有經(jīng)典的三羧酸循環(huán)途徑。2011年Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，在聚球藻PCC7002中a2770和a2771基因分別編碼α-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶，這2個(gè)酶的存在使得藍(lán)藻的三羧酸循環(huán)變得完整[4]。實(shí)際上，編碼α-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶的基因存在于除少數(shù)海洋藍(lán)藻外的大多數(shù)藍(lán)藻中[4]。

筆者所在研究組通過(guò)Blast序列分析，發(fā)現(xiàn)藍(lán)桿藻ATCC 51142中cce4227基因與聚球藻PCC7002中a2770基因的同源性達(dá)到81.8%，與集胞藻PCC6803中sll1981基因的同源性為76%。同樣，集胞藻PCC6803中sll1981基因編碼蛋白已被證明具有α-酮戊二酸脫羧酶功能[5-6]。因此本研究推測(cè)cce4227蛋白也具有α-酮戊二酸脫羧酶的功能。

近年來(lái)生物合成可再生燃料的研究吸引了越來(lái)越多研究者的關(guān)注[7]。其中，引人注目的是Genomatica公司的研究人員報(bào)道了基因工程大腸桿菌利用琥珀酸半醛生物合成1，4-丁二醇[8]。然而通過(guò)基因工程藍(lán)藻生物合成1，4-丁二醇的研究還未見(jiàn)報(bào)道。琥珀酸半醛正是α-酮戊二酸脫羧酶催化α-酮戊二酸非氧化脫羧生成的產(chǎn)物。因此對(duì)α-酮戊二酸脫羧酶開(kāi)展研究將為未來(lái)利用藍(lán)藻生物合成1，4-丁二醇提供理論基礎(chǔ)。

本研究從藍(lán)桿藻ATCC 51142基因組中擴(kuò)增得到cce4227基因，將其連接到pET28a載體上構(gòu)建得到pET28a-cce4227質(zhì)粒。將該質(zhì)粒與pTf16分子伴侶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后得到表達(dá)菌株。搖瓶培養(yǎng)表達(dá)菌株經(jīng)阿拉伯糖和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后純化得到cce4227重組蛋白。本研究為進(jìn)一步闡明cce4227蛋白的催化功能及機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 試驗(yàn)于2017年11月至2018年1月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

pTf16分子伴侶質(zhì)粒、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、表達(dá)載體pET28a為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；藍(lán)桿藻ATCC 51142基因組購(gòu)于美國(guó)模式菌種保藏中心。

1.1.2 工具酶和主要試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、5K DNA Marker購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Protein Marker購(gòu)于Thermo Scientific公司；2×Taq(Pfu)、2×TaqMix、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；鎳離子親和層析樹(shù)脂(Ni-NTA)購(gòu)于QIAGEN(凱杰)公司；所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；質(zhì)粒測(cè)序由上海祥音生物科技有限公司完成；其他主要試劑均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增 以藍(lán)桿藻ATCC 51142基因組為模板(1 μL，約30 ng)，加入上下游引物各1 μL(表1)，引物終濃度為0.2 μmol/L。加入2×Taq(Pfu)25 μL后加入滅菌水22 μL至總體積為50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃保溫。

表1 PCR引物序列

注：下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.2.2 pET28a-cce4227重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后回收，利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切回收片段。用同樣的酶雙酶切pET28a載體。將雙酶切的基因片段cce4227和載體線性片段pET28a(基因片段與載體片段的物質(zhì)的量之比為6 ∶1)在16 ℃金屬浴恒溫下用T4 DNA連接酶過(guò)夜連接。取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)(80 μL)后，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。將經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆單菌落搖菌提取質(zhì)粒后送檢測(cè)序。

1.2.3 cce4227重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET28a-cce4227和pTf16分子伴侶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(100 μL)，涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(25 μg/mL)的雙抗性LB固體平板培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫箱內(nèi)倒置過(guò)夜培養(yǎng)，將其克隆單菌落PCR驗(yàn)證為正確的陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單克隆菌落加入10 mL含有卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(25 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，于 37 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。然后按0.5%接種量將過(guò)夜培養(yǎng)液加入1.2 L LB液體培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL 氯霉素和1 mg/mL阿拉伯糖)中進(jìn)行菌體擴(kuò)大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液D600 nm為0.6時(shí)冰浴后加入IPTG(終濃度為 0.2 mmol/L)于16 ℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 cce4227重組蛋白的分離純化 將離心所得菌體用20倍體積的平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.0)重懸，于冰水浴中超聲破碎32 min(超聲工作2 s，間歇8 s，有效功率為10%)。菌體裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心1 h得到菌體上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，將上清過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂(事先用平衡緩沖液進(jìn)行平衡處理)，然后用含咪唑的平衡緩沖液進(jìn)行濃度梯度洗脫，分別收集每個(gè)濃度的流出液，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)目的蛋白。合并含有目的蛋白的洗脫液后，于4 ℃采用透析袋進(jìn)行濃縮透析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-cce4227表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以藍(lán)桿藻ATCC 51142基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳后獲得約1.7 kb大小的DNA條帶，該基因片段與cce4227基因理論堿基數(shù)(1 653 bp)相吻合(圖1)。將雙酶切后的cce4227基因片段和pET28a載體線性片段(圖2)經(jīng)T4 DNA連接酶過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆搖菌后提取質(zhì)粒。將該質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，該基因序列與National Center for Biotechnology Information(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)中的cce4227基因序列完全一致。因此可見(jiàn)，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pET28a-cce4227表達(dá)載體。

2.2 cce4227重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET28a-cce4227表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，搖瓶培養(yǎng)菌液后經(jīng)IPTG(0.2 mmol/L)誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)cce4227重組蛋白為包涵體，在上清液中沒(méi)有可見(jiàn)的cce4227重組蛋白(圖3)。因此本試驗(yàn)將pET28a-cce4227質(zhì)粒和pTf16分子伴侶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR研究發(fā)現(xiàn)，pET28a-cce4227質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，即構(gòu)建成功pET28a-cce4227/pTf16 BL21(DE3)(圖4中2、3、5、6條帶片段大小與cce4227基因片段大小相符合)。挑取圖4中2號(hào)單克隆菌落搖菌培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTf16分子伴侶質(zhì)粒的共表達(dá)明顯增加了cce4227蛋白的可溶性(圖3)。cce4227基因的堿基數(shù)為1 653 bp，編碼1個(gè)含有550個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其分子量為59.91 ku，與圖3中大小約為60 ku的條帶一致。

2.3 pET28a-cce4227/pTf16重組蛋白的分離純化

將含有目的蛋白的上清液用Ni-NTA親和層析柱純化。用含有20～200 mmol/L咪唑的緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.0)進(jìn)行洗脫(圖5)。由于pTf16分子伴侶質(zhì)粒表達(dá)的促發(fā)因子(trigger factor，簡(jiǎn)稱TF)蛋白沒(méi)有組氨酸標(biāo)簽，不能被Ni-NTA吸附。當(dāng)咪唑濃度增加到40 mmol/L時(shí)，TF蛋白基本被洗脫，此時(shí)有少量cce4227重組蛋白被洗脫。當(dāng)咪唑濃度提高到60 mmol/L時(shí)，大量cce4227重組蛋白被洗脫。然后用含有100 mmol/L咪唑的緩沖液將cce4227重組蛋白全部洗脫。合并圖5中含有cce4227重組蛋白的洗脫液后濃縮脫鹽，得到純度>95%的cce4227重組蛋白。菌體蛋白收率約為 12 mg/g 。

3 討論

本研究通過(guò)Blast序列分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)桿藻ATCC 51142中cce4227基因與集胞藻PCC6803中sll1981基因的同源性為76%[6]，與魚(yú)腥藻PCC7120中all3555基因的同源性為74%；藍(lán)桿藻ATCC 51142中cce4228基因與聚球藻PCC7002中a2771基因的同源性為68%，與魚(yú)腥藻PCC7120中all3556基因的同源性為71%[9-10]。重要的是藍(lán)桿藻ATCC 51142中cce4227蛋白與集胞藻PCC6803中sll1981蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)86%，且sll1981蛋白已經(jīng)被證實(shí)具有α-酮戊二酸脫羧酶的功能[5]，因此推測(cè)cce4227蛋白也具有α-酮戊二酸脫羧酶的功能。

本研究通過(guò)常規(guī)PCR技術(shù)從藍(lán)桿藻ATCC 51142基因組中成功克隆到cce4227基因，然后將其連接到pET-28a載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性單克隆菌落經(jīng)測(cè)序正確后得到蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET28a-cce4227。雖然該表達(dá)菌株中cce4227重組蛋白的表達(dá)效果較好，但是其在上清液中的含量較低，大部分為包涵體蛋白。因此，將pET28a-cce4227質(zhì)粒與pTf16分子伴侶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，與分子伴侶蛋白(TF蛋白)共表達(dá)時(shí)，cce4227重組蛋白的可溶性得到提高，在上清液中有明顯可見(jiàn)的cce4227蛋白。經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后通過(guò)Ni-NTA親和層析方法獲得純度較高的cce4227蛋白，菌體蛋白收率達(dá)到12 mg/g。SDS-PAGE測(cè)得的cce4227蛋白分子量約為 60 ku，與cce4227蛋白的理論分子量(59.91 ku)比較接近。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室已有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在焦磷酸硫胺素作輔因子時(shí)，cce4227蛋白可以催化α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛。當(dāng)用pH值為7.5、濃度為100 mmol/L的HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液時(shí)，cce4227蛋白對(duì)α-酮戊二酸的Km(米氏常數(shù))為1.21 mmol/L，kcat(催化常數(shù))為1.16 s。后續(xù)研究將對(duì)cce4227蛋白的詳細(xì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)及結(jié)構(gòu)功能關(guān)系作進(jìn)一步測(cè)定。