陳龍軍， 陳濟(jì)琛， 林曉栩，， 邱宏端， 林新堅(jiān)， 蔡海松*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建 福州 350003；2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州350108）

環(huán)糊精（cyclodextrins，簡稱CD）作為一類重要的工農(nóng)業(yè)原材料，廣泛運(yùn)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和環(huán) 保 等 領(lǐng) 域[1]。 而 環(huán) 糊 酶 （cyclodextrin glycosyltransferase，簡稱CGTase）是生物酶法生產(chǎn)環(huán)糊精的重要工業(yè)用酶，它屬于α-淀粉酶家族中的一類復(fù)合型多功能酶[2]，能夠催化環(huán)化反應(yīng)、歧化反應(yīng)、偶合反應(yīng)和水解反應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道，CGTase的獲取方式大致歸納為3種：從自然界中篩選野生菌株；根據(jù)基因文庫進(jìn)行克隆表達(dá)；對已知目的基因片段進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改良。其中野生菌株篩選不僅最為直接有效，而且也是后兩種方式的基礎(chǔ)[3-4]。

盡管不斷有新的CGTase得到分離鑒定，但是天然菌株穩(wěn)定性差、產(chǎn)酶量低、分離純化困難、不易工業(yè)化等缺陷極大限制了CGTase的工業(yè)化應(yīng)用。隨著近代分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用生物工程手段實(shí)現(xiàn)CGTase基因的異源超量表達(dá)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。其中原核表達(dá)多有報(bào)道[5-7]，但真核酵母系統(tǒng)表達(dá)CGTase鮮見報(bào)道，目前僅見兩篇文獻(xiàn)[8-9]有相關(guān)報(bào)道，表達(dá)效果亦不甚理想。畢赤酵母作為一種高效表達(dá)系統(tǒng)，遺傳背景清晰，成功實(shí)現(xiàn)了多種外源蛋白質(zhì)的高效表達(dá)，探索環(huán)糊精酶在畢赤酵母中表達(dá)的可行性具有重要意義。因此作者以前期從嗜熱芽孢桿菌 CHB1中分離獲得的新型環(huán)糊精酶基因?yàn)榛A(chǔ)，以畢赤酵母GS115為表達(dá)系統(tǒng)，通過密碼子優(yōu)化，比較密碼子調(diào)整對環(huán)糊精酶表達(dá)效果的影響，以期實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母的異源表達(dá)，為該CGTase的實(shí)際應(yīng)用提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株和質(zhì)粒嗜熱芽孢桿菌CHB1（含新型環(huán)糊精酶基因）、Escherichia coliDH5α：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；GS115、pPICZαA：Invitrogen 公司。

試劑與儀器限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Mark、T4DNA 連接酶：TaKaRa 公司；DNA切膠回收試劑盒、PCR引物、博來霉素及質(zhì)粒快速提取試劑盒：上海生工股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。3-18K低溫高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；PCR儀：基因有限公司；蛋白質(zhì)電泳儀：美國BIO-RAD公司；Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國Thermo公司。

培養(yǎng)基

1）地芽孢桿菌CHB1生長培養(yǎng)基（組分g/L）：大豆蛋白胨10，牛肉浸膏5，氯化鈉0.2；pH 7.0。

2）低鹽 LB 培養(yǎng)基（組分 g/L）：胰蛋白胨 10，酵母浸膏5，氯化鈉5；固體培養(yǎng)基添加2 g/dL瓊脂。

3）YPG 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 20，酵母粉 10，甘油20；固體培養(yǎng)基添加2 g/dL瓊脂。

4）BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母浸出物10 g，加入 500 mL水，121℃滅菌 20 min，冷至室溫加入滅菌的 PBS l00 mL，10×YNB 100 mL，500×B 2 mL（過濾除菌），10×GY 100 mL，定容到 1 L；

5）BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母浸出物10 g，加入 500 mL水，121℃滅菌 20 min，冷卻至室溫加入滅菌的 PBS l00 mL，10×YNB 100 mL，500×B 2 mL（過濾除菌），甲醇 5 mL，定容到 1 L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因組DNA和質(zhì)粒的提取地芽孢桿菌CHB1基因組DNA的提取參照Zhou J[10]的方法進(jìn)行。質(zhì)粒的提取參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書的方法進(jìn)行（上海生工股份有限公司）。

野生型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆根據(jù)地芽孢桿菌CHB1環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（CGT1基因）序列，設(shè)計(jì)上下游引物如下：

CGT-F1：5'-CTGAATTCGCTGGAAATCTTAAT AAGG-3'（下劃線為限制性酶EcoRI）；

CGT-R1：5'-TGGCGGCCGCGTTTTGCCAATTC ACTATAA-3'（下劃線為限制性酶NotI）；

以地芽孢桿菌CHB1基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增CGT1基因，擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 90 S，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸 10 min；4℃保存；PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過膠回收純化PCR產(chǎn)物，16℃下 與pMD18-T載體進(jìn)行過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli DH5α，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，同時(shí)提取pMD18T-CGT1質(zhì)粒送至上海生工有限公司測序驗(yàn)證。

環(huán)糊精酶（CGT）基因密碼子優(yōu)化及克隆根據(jù)CGT1的氨基酸組成，考慮畢赤酵母的堿基偏好性[11]，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時(shí)在CGT1基因首末端分別引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I及Not I，將優(yōu)化序列CGT2送至上海生工生物工程有限公司合成，連入pMD-18T載體，構(gòu)建質(zhì)粒pMD18T-CGT2。

原始基因與優(yōu)化基因表達(dá)載體及重組菌構(gòu)建載體 pMD18T-CGT1、pMD18T-CGT2 及 pPICZαA分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，分別膠回收 CGT1、CGT2基因片段及 pPICZαA線性載體；參照TaKaRa公司T4 DNA連接酶使用說明書，將CGT1、CGT2基因片段分別與pPICZαA線性載體混合進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)25 μg/mL博來霉素抗性LB平板及菌落PCR鑒定，構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαACGT1和pPICZαA-CGT2；同時(shí)提取相應(yīng)質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序驗(yàn)證。

分別用限制性內(nèi)切酶Sac I、Pme I對重組表達(dá)載體pPICZαA-CGT1和 pPICZαA-CGT2進(jìn)行線性化，膠回收后，利用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入感受態(tài)畢赤酵母GS115中，于100 μg/mL博來霉素抗性YPG平板培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)CGTase效果比較將篩選獲得的環(huán)糊精酶重組工程菌分別接種在含有100 mL YPG培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，在200 r/min、30℃下培養(yǎng)24 h；以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于含有200 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，培養(yǎng)至OD600為 6～8。 4℃、5 000 r/min收集酵母細(xì)胞，同時(shí)補(bǔ)加適量BMMY培養(yǎng)基重懸酵母，以后每24小時(shí)取樣測環(huán)糊精酶活力，并補(bǔ)加1%甲醇。

環(huán)糊精酶搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化為提高環(huán)糊精酶在畢赤酵母中的表達(dá)效率，作者對影響酵母表達(dá)的重要因素（誘導(dǎo)溫度、pH值、誘導(dǎo)甲醇體積分?jǐn)?shù)等）進(jìn)行優(yōu)化。將重組菌接種于含100 mL YPG培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中。在200 r/min、30℃下培養(yǎng)24 h，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到含有BMGY培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，在200 r/min、30℃下培養(yǎng)24 h；4℃、5 000 r/min收集酵母細(xì)胞，同時(shí)補(bǔ)加適量BMMY培養(yǎng)基重懸酵母。以后每24小時(shí)補(bǔ)加1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶。誘導(dǎo)溫度分別設(shè)為22、25、28、30、32 ℃；pH 設(shè)置為 4、5、5.5、6、6.5、7 共六個(gè)梯度；甲醇體積分?jǐn)?shù)梯度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化以每24小時(shí)取樣測定酶活性、OD600來確定最佳發(fā)酵時(shí)間。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，分別測定環(huán)糊精酶活性和細(xì)胞密度OD600值。

環(huán)糊精酶活性測定測定環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的方法參照甲基橙褪色法[11]并作適當(dāng)改進(jìn)。取50 mmol/L pH 6.0磷酸鈉緩沖液配制的3 g/dL可溶性淀粉溶液0.9 mL于試管中，將試管置于60℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱2 min，然后往試管內(nèi)加入離心得到的發(fā)酵液上清液即粗酶液或適當(dāng)稀釋的純酶液 0.1 mL，反應(yīng) 10 min，加入 1.0 mL、1 mol/L 鹽酸溶液終止反應(yīng)，再加入0.1 mmol/L的甲基橙溶液1.0 mL，振蕩混勻后于16℃保溫20 min，用酶標(biāo)儀于波長505 nm處測定溶液的吸光度并根據(jù)空白計(jì)算褪色程度（ΔA），最后根據(jù)α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出α-環(huán)糊精的質(zhì)量濃度。酶活性單位定義為：60℃、pH 6.0 下，每分鐘催化產(chǎn)生 1 μmol α-環(huán)糊精所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱芽孢桿菌基因組提取及原始環(huán)糊精酶基因克隆

以嗜熱芽孢桿菌CHB1的基因組DNA為模板，以CGT-F1和CGT-R1為上下游引物擴(kuò)增原始環(huán)糊精酶CGT1，電泳結(jié)果見圖1。擴(kuò)增獲得大小在2 000 bp左右的特異性DNA片段，與目的基因片段大?。? 031 bp）一致。進(jìn)一步進(jìn)行基因測序，結(jié)果顯示擴(kuò)增序列與原始環(huán)糊精酶100%一致，至此，成功獲得大小和序列均正確的原始環(huán)糊精酶CGT1。將克隆獲得的CGT1與pMD18T連接，通過CGT-F1/CGT-R1引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖2。在2 kb左右獲得預(yù)期大小的DNA片段，經(jīng)測序后構(gòu)建獲得克隆載體pMD18T-CGT1。

圖1 嗜熱芽孢桿菌基因組及CGTase基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis of CGTgene and Gebacillius sp.CHB1 genome

圖2 克隆載體pMD18T-CGT1菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 Colony PCR validation of pMD18T-CGT1

2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證

以EcoRI和NotI為雙酶切體系，分別對載體pMD18T-CGT1、pMD18T-CGT2 及 pPICZαA 進(jìn)行雙酶切，回收 2 000 bp（CGT1）、2 000 bp（CGT2）及3 600 bp線性載體pPICZαA。將回收片段CGT1和CGT2分別與線性載體pPICZαA連接，篩選克隆子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果見圖3。出現(xiàn)了預(yù)期大小的兩條帶；挑取2、4號克隆子提質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測序驗(yàn)證，由測序結(jié)果看出，原始基因CGT1和優(yōu)化基因CGT2，均正確插入到pPICZαA，成功構(gòu)建分泌型重組質(zhì)粒 pPICZαA-CGT1和 pPICZαACGT2。

2.3 重組環(huán)糊精酶畢赤酵母工程菌構(gòu)建及驗(yàn)證

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-CGT1和pPICZαACGT2經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶線性化后，分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，提取重組酵母基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以酵母信號肽為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)上游引物α-factor（5'-CAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATC-3'）， 分 別 以CGT-R1，CGT-R2為下游引物，進(jìn)行原始基因與優(yōu)化基因的擴(kuò)增驗(yàn)證，電泳結(jié)果見圖4。重組酵母可擴(kuò)增得到大小2 100 bp，與預(yù)期大小一致，同時(shí)將PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序，結(jié)果顯示環(huán)糊精酶基因已成功整合入酵母染色體，并處于分泌信號肽α因子下游；至此獲得兩株穩(wěn)定遺傳的環(huán)糊精酶重組畢赤酵母工程菌，GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2。

圖3 重組載體pPICZαA-CGT構(gòu)建Fig.3 Agarose gelelectrophoresisofpPICZαACGT1and pPICZαA-CGT2

圖4 重組酵母基因組PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR of recombinant Pichia pastoris

2.4 重組菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果比較

以相同的誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)重組酵母GS115/pPICZαA-CGT1與 GS115/pPICZαA-CGT2 表達(dá)環(huán)糊精酶，比較密碼子優(yōu)化前后環(huán)糊精酶的活性變化。由圖5產(chǎn)酶曲線可看出，誘導(dǎo)96 h后酶活力趨于穩(wěn)定，經(jīng)過120 h誘導(dǎo)后，原始環(huán)糊精酶CGT1酵母胞外表達(dá)活性達(dá)到最高，為0.37 U/mL，是張佳瑜[9]等表達(dá)的環(huán)糊精酶活性的1.6倍。而優(yōu)化基因CGT2經(jīng)過120 h后活性達(dá)到0.62 U/mL，是優(yōu)化前CGT1活性的1.7倍，說明通過堿基偏好性的優(yōu)化，將原始基因中的低頻密碼子優(yōu)化成酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高頻密碼子，有利于提高環(huán)糊精酶在畢赤酵母中的表達(dá)量。

圖5 密碼子優(yōu)化前后環(huán)糊精酶工程菌表達(dá)效果比較Fig.5 Comparison of cyclodextrin enzyme activities between GS115/pPICZαA -CGT1andGS115/pPICZαA-CGT2

2.5 重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化

對堿基優(yōu)化后的環(huán)糊精酶工程菌GS115/pPICZαA-CGT2進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，以誘導(dǎo)發(fā)酵120 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間，優(yōu)化包括誘導(dǎo)溫度、pH及甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)等主要因素，結(jié)果見圖6（a）。隨著誘導(dǎo)溫度的提升，環(huán)糊精酶活性逐漸升高，當(dāng)誘導(dǎo)溫度達(dá)到28℃，環(huán)糊精酶活性達(dá)到最大值0.76 U/mL，隨著溫度繼續(xù)升高，活性逐漸下降，究其原因可能是高溫加速了酵母自身蛋白酶的表達(dá)，導(dǎo)致環(huán)糊精酶蛋白被降解。不同pH對酵母表達(dá)外源蛋白具有重要影響，結(jié)果見圖6（b）。環(huán)糊精酶胞外活性隨著pH的逐漸升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH 6.5時(shí)，活性達(dá)到最高的0.96 U/mL。甲醇作為碳源及誘導(dǎo)劑，其添加量對環(huán)糊精酶的表達(dá)至關(guān)重要。由圖6（c）可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酶活力及菌體量逐漸增加，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，可能是由于甲醇本身對酵母細(xì)胞的毒性，過量的甲醇不利于表達(dá)外源蛋白質(zhì)。通過主要條件的優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵條件：pH 6.5，溫度28℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)為每24小時(shí)1.5%，誘導(dǎo)120 h酶活力達(dá)到1.26 U/mL，是優(yōu)化前的2倍。

圖6 重組菌的發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.6 Optimization of fermentation conditions

3 結(jié)語

作者從嗜熱脂肪芽孢桿菌CHB1中擴(kuò)增獲得新型CGT酶基因全序列，并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的異源表達(dá)。原始基因CGT1，在切除其自身信號肽，插入pPICZɑA表達(dá)載體的ɑ-Factor信號肽之后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得了基因工程菌GS115/pPICZαA-CGT1，其胞外環(huán)糊精酶活力為0.37 U/mL，高于張佳瑜[9]等表達(dá)的環(huán)糊精酶活性。堿基密碼子優(yōu)化后的CGT2，通過同樣手段構(gòu)建獲得工程菌GS115/pPICZαA-CGT2，其胞外酶活力達(dá)到0.62 U/mL，是優(yōu)化前CGT1活性的1.7倍；進(jìn)一步對該重組菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為pH6.5、28℃、200 r/min、每 24小時(shí)補(bǔ)加 1.5%的甲醇誘導(dǎo)，120 h后其胞外酶活力達(dá)到1.26 U/mL，是優(yōu)化前的2倍。

許多研究表明，外源基因密碼子優(yōu)化對提高外源蛋白質(zhì)表達(dá)量具有顯著作用，可提高幾倍甚至數(shù)十倍[13-15]。本研究通過畢赤酵母密碼子優(yōu)化網(wǎng)站（http：//www.kazusa.or.jp/、http：//www.genscript.com等）及趙翔[11]關(guān)于畢赤酵母密碼子的分析，對野生環(huán)糊精酶基因密碼子在畢赤酵母中的使用頻率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母低頻率密碼子在該基因中所占比例高達(dá)11%，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后低頻密碼子使用頻率降至6%，其酵母表達(dá)活性相應(yīng)提高了1.7倍，說明密碼子優(yōu)化對CGT的表達(dá)效率確實(shí)有一定促進(jìn)作用，但表達(dá)仍不甚理想，亦低于前期大腸桿菌的表達(dá)效果。進(jìn)一步通過氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)在環(huán)糊精酶AA序列中含有多達(dá)11個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)序列Asn-Xaa-Thr/Ser（其中aa代表所有氨基酸）；這些位點(diǎn)可能導(dǎo)致環(huán)糊精酶在畢赤酵母內(nèi)被過度糖基化，從而影響了環(huán)糊精酶的活性。下階段考慮對酶蛋白實(shí)施去糖基化改造，考察糖基化對酶活力的具體影響；同時(shí)優(yōu)化其他相關(guān)因素如信號肽、表達(dá)載體、表達(dá)宿主等，最大限度提高其在酵母中的表達(dá)效果。另外，鑒于本研究的環(huán)糊精酶基因來自芽孢桿菌，考慮通過芽孢桿菌同源表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)該環(huán)糊精酶的高效表達(dá)，為環(huán)糊精酶的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。