劉 葉 ， 鞏 旭 ， 康 振 ， 堵國(guó)成 ， 陳 堅(jiān) ， 華兆哲 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

葡萄糖二酸（Glucaric acid）是一種自然界存在的高附加值有機(jī)酸，在十字花科蔬菜、櫻桃和柑橘類(lèi)水果中含量豐富，少量存在于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物中[1]。葡萄糖二酸及其衍生物具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，它可以降低膽固醇[1]、治療糖尿病[2]、預(yù)防癌癥[3]等，同時(shí)，在合成生物可降解的聚合物、羥基化尼龍等新型材料方面也有大量的應(yīng)用[4-5]，曾被美國(guó)能源部確定為“最具價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品”之一[6]。

目前，葡萄糖二酸的制備方法主要為化學(xué)法，如硝酸氧化、 以 2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）為催化劑的共催化氧化等[7]。此方法投入高、得率低，同時(shí)產(chǎn)生的廢氣廢液對(duì)環(huán)境造成一定的污染。由于化學(xué)法存在的局限性，生物法制備葡萄糖二酸越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。葡萄糖二酸與抗壞血酸是哺乳動(dòng)物中葡萄糖醛酸代謝途徑的終產(chǎn)物，然而，從葡萄糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反應(yīng)[8]。Prather等通過(guò)在大腸桿菌中異源表達(dá)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）來(lái)源的肌醇-1-磷酸合成酶基因（Ino1）、小鼠來(lái)源的肌醇氧化酶基因（MIOX）以及丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）來(lái)源的醛酸脫氫酶基因（udh），成功構(gòu)建葡萄糖二酸合成途徑，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖二酸的生物合成[9-11]。通過(guò)優(yōu)化途徑、提高M(jìn)IOX的穩(wěn)定性及前體物質(zhì)肌醇的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，在補(bǔ)加肌醇的條件下，葡萄糖二酸的產(chǎn)量達(dá)到了4.85 g/L。但是，大腸桿菌耐酸能力弱，易受噬菌體感染，并具有潛在的致病性，因此在工業(yè)上難以推廣應(yīng)用。

畢赤酵母是一種單細(xì)胞真核生物，具有營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)基廉價(jià)、可進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)[12]。相比大腸桿菌，畢赤酵母具有真核生物表達(dá)時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的加工和修飾等功能[13]，同時(shí)，畢赤酵母耐酸能力較強(qiáng)（pH 3～7）[14]，因此是一種可用于生產(chǎn)功能性有機(jī)酸的優(yōu)良宿主。

在本研究中，我們通過(guò)異源表達(dá)小鼠來(lái)源的MIOX基因及Pseudomonas putidaKT2440來(lái)源的udh基因，成功在畢赤酵母內(nèi)構(gòu)建了葡萄糖二酸合成途徑，通過(guò)對(duì)碳源、初始pH、接種齡及接種量進(jìn)行搖瓶水平的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了葡萄糖二酸的產(chǎn)量。最后，我們按照搖瓶?jī)?yōu)化的條件，對(duì)重組菌在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了補(bǔ)料分批培養(yǎng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒Pichia pastorisGS115：本研究中代謝工程改造的宿主菌株；Pseudomonas putidaKT2440：用于 udh基因的克??；Escherichia coliJM109、E.coliTOP10：用于構(gòu)建質(zhì)粒的宿主菌；質(zhì)粒pUC57-mM：含小鼠來(lái)源的MIOX基因，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并按照畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化；質(zhì)粒pPIC9K、pGAPZB：用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 10。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

YPD 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖20。

YPDM 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖 20，肌醇 10。

YPDS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖 20，山梨醇 182.2。

MD 固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，YNB 13.4，生物素 4×10-4，瓊脂 20。

改良 BSM 培養(yǎng)基 （g/L）：85%磷酸 26.7 mL，CaSO40.93，K2SO418.2，MgSO47.275，KOH 4.125，PTM1離子液4.35 mL，葡萄糖60，肌醇13。

PTM1 離子液 （g/L）：CuSO4·5H2O 6，KI 0.08，MnSO4·H2O 3，H3BO30.02，MoNa2O4·H2O 0.2，CoCl20.5，ZnCl220，F(xiàn)eSO4·7H2O 65，生物素 0.2；濃 H2SO45.0 mL。

1.1.3 酶、引物、DNA Marker及相關(guān)試劑盒Primer STAR DNA聚合酶，DNA Marker，T4 DNA連接酶，大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒：購(gòu)自TaKaRa（大連）；各種限制性?xún)?nèi)切酶：購(gòu)自Thermo公司；PCR引物（見(jiàn)表1）：由上海生工生物有限公司合成；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、細(xì)菌總DNA提取試劑盒：購(gòu)自上海生工生物有限公司；酵母基因組提取試劑盒：購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；葡萄糖二酸鉀色譜級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建以pGAPZB質(zhì)粒為模板，TU-1-F、TU-1-R為引物擴(kuò)增畢赤酵母組成型啟動(dòng)子TEF，同時(shí)以惡臭假單胞菌 （P.putidaKT2440）基因組為模板，TU-2-F、TU-2-R為引物擴(kuò)增udh基因。使用融合PCR方法，將TEF啟動(dòng)子與udh基因融合。使用限制性?xún)?nèi)切酶SacI和NotI對(duì)得到的融合片段雙酶切，連接至具有相應(yīng)切口的表達(dá)載體pPIC9K上，轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中，在確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KTEF-U，經(jīng)DNA測(cè)序比對(duì)，重組序列正確。以pUC57-mM質(zhì)粒為模板，mM-F、mM-R為引物擴(kuò)增小鼠來(lái)源的MIOX基因，使用XhoI和XbaI連接至具有相應(yīng)切口的表達(dá)載體pGAPZB上，轉(zhuǎn)化E.coliTOP10中，在確保閱讀框正確的前提下，鑒定出重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZB-M，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，序列正確。

表1 本文所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子篩選將質(zhì)粒pPIC9KTEF-U經(jīng)SalI線(xiàn)性化之后，采用電轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化至P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞中，在MD培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，30℃恒溫倒置培養(yǎng)3～4 d。挑選MD平板上生長(zhǎng)良好的單菌落分別接種至含有1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板中，篩選抗高質(zhì)量濃度G418（4.0 mg/mL）的重組畢赤酵母，以重組子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得重組菌株。將質(zhì)粒pGAPZB-M經(jīng)BspHI線(xiàn)性化，轉(zhuǎn)化上述重組菌感受態(tài)中，涂布于含100 μg/mL博萊霉素的YPDS平板上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)3～4 d。挑選生長(zhǎng)良好的單菌落接種至分別含有500、1 000、1 500、2 000 μg/mL博萊霉素的YPDS平板上，篩選抗高濃度博萊霉素（2 000 μg/mL）的重組子，以重組子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得重組菌株。

1.2.3 重組畢赤酵母菌株培養(yǎng)條件

1）搖瓶培養(yǎng)：將重組菌單菌落接種至25 mL（搖瓶容量為250 mL）種子培養(yǎng)基YPD中，30℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，將種子培養(yǎng)液按10%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至50 mL（搖瓶容量為500 mL）的發(fā)酵培養(yǎng)基YPDM中發(fā)酵，培養(yǎng)60 h。

2）3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將重組菌單菌落接種至50 mL（搖瓶容量為 500 mL）YPD 培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，將種子培養(yǎng)液按25%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至含1 L改良BSM發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中。使用80%氨水控制pH為5.5，溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min，通氣量為4 vvm。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度低于5 g/L時(shí)，流加葡萄糖維持質(zhì)量濃度在0～5 g/L之間。

1.2.4 葡萄糖二酸的檢測(cè)

1）定性檢測(cè)：發(fā)酵結(jié)束后，取1 mL發(fā)酵液在12 000 r/min下離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用于島津離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LCMSIT-TOF）分析[15]。流動(dòng)相：A：1 mmol/L 甲酸銨+0.01%甲酸+水；B：1 mmol/L 甲酸銨+乙腈；洗脫程序：0～12 min 30%B；12～30 min 30%～65%B；30～31 min 65%～95%B；31～35 min 95%B；35～36 min 95%～30%B；36～40 min 30%B； 色譜柱：Shim-pack VPODS（150 L×2.0）；流速：0.15 mL/min 進(jìn)樣量：5 μL；離子化模式：電噴霧負(fù)離子模式；霧化氣流速：1.5 L/min；CDL溫度：200℃，HB 溫度：200℃；掃描范圍：MS1，m/z：150～300。

2）定量檢測(cè)：取樣品發(fā)酵液上清液，經(jīng)Affi-Gel凝膠處理[16]后，用高效液相色譜儀（HPLC）分析。流動(dòng)相：5 mmol/L稀硫酸；色譜柱：Aminex HPX-87H；流速 0.5 mL/min；柱溫：55 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：UV（檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm）。

1.2.5 MIOX及Udh的活性測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在12 000 r/min、4℃下離心5 min，棄上清液。將菌體用Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 8.0）清洗兩遍后，重懸在清洗緩沖液中。在重懸菌體加入1.0 mm硅珠，采用FastPrep-24均質(zhì)破碎儀破碎，破壁后離心，上清液用來(lái)檢測(cè)途徑酶活性。MIOX及Udh的活性檢測(cè)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

MIOX單位酶活定義：1 min內(nèi)生成1 nmol/L醛酸所需要的酶量；Udh單位酶活定義：1 min內(nèi)生成1 μmol/L NADH所需要的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定及重組菌的構(gòu)建

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KTEF-U用SacI和NotI雙酶切，得到約8.3 kb與1.2 kb的兩條可見(jiàn)特異性DNA條帶，見(jiàn)圖1（a），分別對(duì)應(yīng)于切除AOX啟動(dòng)子的線(xiàn)性化pPIC9K和融合片段TEF-Udh。重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZB-M經(jīng)XhoI、XbaI雙酶切，得到約2.9 kb與 858 bp的兩條可見(jiàn)特異性DNA條帶，見(jiàn)圖1（b），分別對(duì)應(yīng)于線(xiàn)性化的pGAPZB和目的基因MIOX。上述結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KTEF-U及pGAPZB-M均構(gòu)建成功。

將重組質(zhì)粒pPIC9KTEF-U采用電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌，命名為P.pastorisGS115-TU，進(jìn)一步將重組質(zhì)粒pGAPZB-M轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115-TU感受態(tài)細(xì)胞中，獲得相應(yīng)的重組菌，命名為P.pastorisGS115-TUM。

圖1 雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒Fig.1 Confirmation of recombinant plasmids by digestion

2.2 重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖二酸

將重組菌P.pastorisGS115-TUM及對(duì)照菌P.pastorisGS115在搖瓶中培養(yǎng)60 h后，取1 mL上清液進(jìn)行LCMS-IT-TOF質(zhì)譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。在P.pastorisGS115-TUM發(fā)酵上清液中成功檢測(cè)到葡萄糖二酸（m/z=209），而對(duì)照菌P.pastorisGS115并未檢測(cè)到葡萄糖二酸。該結(jié)果表明，通過(guò)引入MIOX基因及udh基因，在重組菌P.pastorisGS115-TUM中已成功實(shí)現(xiàn)葡萄糖二酸的合成，而原始菌株并不具有生成葡萄糖二酸的能力。為了進(jìn)一步分析途經(jīng)，我們對(duì)途經(jīng)酶MIOX及Udh的活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。MIOX并未檢測(cè)到明顯的活性，推測(cè)原因?yàn)楸磉_(dá)量較低或不穩(wěn)定，但Udh酶活性較高，后面的研究工作將進(jìn)一步分析并提高M(jìn)IOX的活性。

經(jīng)高效液相色譜（HPLC）定量檢測(cè)，重組菌P.pastorisGS115-TUM在500 mL三角搖瓶中培養(yǎng)60 h 后，葡萄糖二酸產(chǎn)量為（566.36±16.98）mg/L。

圖2 發(fā)酵液中葡萄糖二酸的質(zhì)譜檢測(cè)Fig.2 Mass spectrum of glucaric acid in the culture supernatant

圖3MIOX及Udh酶活性檢測(cè)Fig.3 Specific activities of MIOX and Udh

2.3 搖瓶水平優(yōu)化培養(yǎng)條件提高葡萄糖二酸產(chǎn)量

2.3.1 不同碳源對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響選擇甘油和葡萄糖作為碳源，分別以不同初始質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100 g/L）在 500 mL 搖瓶中培養(yǎng)重組菌P.pastorisGS115-TUM，結(jié)果見(jiàn)圖4。不同的碳源對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)及葡萄糖二酸的產(chǎn)量影響較大，與底物甘油相比，雖然以葡萄糖為碳源獲得的菌體量較低，但是葡萄糖二酸產(chǎn)量明顯高于甘油。由圖4可以看出，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)葡萄糖二酸產(chǎn)量最高，為（830.08±32.60） mg/L，因此選擇葡萄糖作為后期培養(yǎng)的碳源。

圖4 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of carbon sources on recombinant strain and glucaric acid production

2.3.2 不同初始pH對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響配制 初 始 pH 分 別 為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 的YPDM發(fā)酵培養(yǎng)基，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L，將培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液以10%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 h，結(jié)果見(jiàn)圖5。不同初始pH對(duì)菌體量影響不大。pH值為4.0～5.5時(shí)，葡萄糖二酸的產(chǎn)量逐漸增大；當(dāng)pH大于5.5時(shí)，葡萄糖二酸產(chǎn)量略有下降。因此，選擇培養(yǎng)基最適初始pH為5.5。

圖5 初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of initial pH on recombinant strain and glucaric acid production

2.3.3 不同接種齡對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響分別取培養(yǎng) 12、16、20、24、28、32 h 的種子培養(yǎng)液以10%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到初始pH為5.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)60 h，見(jiàn)圖6。在24 h之前，隨著接種齡的增加，葡萄糖二酸產(chǎn)量及菌體量逐漸增加，在24 h之后，菌體量變化不大，但是葡萄糖二酸產(chǎn)量有所下降。因此，選擇最適接種齡為24 h。

2.3.4 不同接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響取培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液分別以5%、10%、15%、20%、25%、30%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至初始pH為5.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)60 h，見(jiàn)圖7。在5%～25%范圍內(nèi)，菌體量、葡萄糖二酸產(chǎn)量與接種體積分?jǐn)?shù)成正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)大于25%時(shí)，菌體量、葡萄糖二酸產(chǎn)量均略有下降。因此，最優(yōu)接種體積分?jǐn)?shù)確定為25%。

圖6 接種齡對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of seed time on recombinant strain and glucaric acid production

圖7 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on recombinant strain and glucaric acid production

2.3.5 不同初始肌醇質(zhì)量濃度對(duì)葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響配制初始肌醇質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 g/L和12 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，初始葡萄糖質(zhì)量濃度60 g/L，初始pH為5.5，將培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液以25%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 h，見(jiàn)圖8。不同初始肌醇質(zhì)量濃度對(duì)菌體量的影響不大。在肌醇質(zhì)量濃度2～10 g/L范圍內(nèi)，葡萄糖二酸產(chǎn)量隨初始肌醇質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)大于10 g/L時(shí)，葡萄糖二酸產(chǎn)量則趨于平穩(wěn)。因此，初始肌醇質(zhì)量濃度確定為10 g/L。

通過(guò)對(duì)碳源、初始pH、接種齡、接種體積分?jǐn)?shù)及初始肌醇質(zhì)量濃度搖瓶水平的優(yōu)化，葡萄糖二酸的產(chǎn)量達(dá)到了（967.60±3.90）mg/L，相比優(yōu)化前的產(chǎn)量（566.36±16.98） mg/L，提高了 70.85%。

2.4 發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)的研究

依據(jù)搖瓶?jī)?yōu)化的結(jié)果，將重組菌P.pastoris GS115-TUM在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。以改良BSM為發(fā)酵培養(yǎng)基，初始葡萄糖質(zhì)量濃度60 g/L，肌醇質(zhì)量濃度13 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，為保證碳源的充足，實(shí)現(xiàn)菌體高密度培養(yǎng)，當(dāng)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度低于5 g/L時(shí)，流加800 g/L葡萄糖母液 （含12 mL/L PTM1），維持殘?zhí)琴|(zhì)量濃度在0～5 g/L之間，結(jié)果見(jiàn)圖9。葡萄糖二酸的生成與菌體的生長(zhǎng)呈正相關(guān)關(guān)系，因此可以判斷為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。在發(fā)酵60 h之前，肌醇的質(zhì)量濃度下降明顯，此時(shí)葡萄糖二酸快速積累。發(fā)酵60 h之后，肌醇的質(zhì)量濃度不再有明顯下降，而葡萄糖二酸的產(chǎn)量也趨于穩(wěn)定。由此可以看出，培養(yǎng)基中添加肌醇有助于葡萄糖二酸的生成，且葡萄糖二酸的積累與肌醇的消耗成正相關(guān)關(guān)系。發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，葡萄糖二酸的產(chǎn)量達(dá)到了（2.60±0.04） g/L。

圖8 初始肌醇質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of initial concentration of myo-inositol on recombinant strain and glucaric acid production

圖9 重組菌3 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)Fig.9 Fed-batch fermentation of recombinant strain in a3 L fermenter

3 結(jié)語(yǔ)

葡萄糖二酸作為一種自然界存在的高附加值有機(jī)酸，具有重要的生物功能。作者通過(guò)在畢赤酵母內(nèi)異源表達(dá)小鼠來(lái)源的MIOX基因及Pseudomonas putida KT2440來(lái)源的udh基因，成功構(gòu)建葡萄糖二酸合成途徑，在添加肌醇的搖瓶培養(yǎng)基中，葡萄糖二酸產(chǎn)量為（566.36±16.98） mg/L。通過(guò)對(duì)碳源、初始pH、接種齡及接種體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化，葡萄糖二酸產(chǎn)量達(dá)到（967.60±3.90）mg/L。按照搖瓶?jī)?yōu)化的條件，我們將重組菌在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，在補(bǔ)加葡萄糖及肌醇的情況下，葡萄糖二酸的產(chǎn)量達(dá)到（2.60±0.04） g/L。

本研究提出的重組畢赤酵母生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法，具有廣闊的發(fā)展前景，為生物法合成葡萄糖二酸提供了新的思路。今后工作將通過(guò)對(duì)畢赤酵母內(nèi)葡萄糖二酸代謝途徑進(jìn)行分子層面的改造及優(yōu)化，以期進(jìn)一步提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量。