尹 花 ， 賀 揚(yáng) ， 董建軍 3，， 陸 健

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；4.啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；5.青島啤酒股份有限公司，山東 青島 266100）

作為一種低酒精度的發(fā)酵飲品，啤酒的風(fēng)味是產(chǎn)品質(zhì)量的重要生命線。啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)主要包括醇類(lèi)、酯類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、呋喃類(lèi)（麥芽香）、吡嗪類(lèi)（麥芽香）、烯類(lèi)（酒花香）、氨基酸類(lèi)等，它們之間微妙的平衡關(guān)系，共同形成了啤酒的風(fēng)味特征。風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)自于以下幾個(gè)途徑：一是原料本身的風(fēng)味成分，例如麥芽和酒花帶來(lái)的麥香和酒花香；二是酵母經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味成分；三是加工過(guò)程中產(chǎn)生的以及后來(lái)貯存過(guò)程中新生成的風(fēng)味物質(zhì)[1]。其中，酵母代謝產(chǎn)生的物質(zhì)是風(fēng)味的重要組成部分，酵母利用麥汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，同時(shí)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物如高級(jí)醇、酯類(lèi)、雙乙酰、乙醛等。這些代謝副產(chǎn)物的種類(lèi)和含量對(duì)啤酒質(zhì)量起著關(guān)鍵作用，某些物質(zhì)含量過(guò)多或過(guò)少，會(huì)造成啤酒口味缺陷，影響整體風(fēng)味質(zhì)量[2-5]。

如何提高產(chǎn)品風(fēng)味特色調(diào)控能力，實(shí)現(xiàn)多品類(lèi)產(chǎn)品的差異化和同品類(lèi)產(chǎn)品的一致性，成為制約規(guī)?；【菩袠I(yè)提升核心競(jìng)爭(zhēng)力、產(chǎn)業(yè)升級(jí)的關(guān)鍵共性難題。啤酒風(fēng)味調(diào)控的研究雖然經(jīng)歷了從粗放的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)式調(diào)整到發(fā)酵工藝與產(chǎn)品風(fēng)味的關(guān)聯(lián)研究，風(fēng)味調(diào)控能力得到了極大提升，但由于工業(yè)化Lager酵母關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)代謝機(jī)制等基礎(chǔ)研究的缺乏，尚不能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控。

大麥?zhǔn)瞧【频闹饕?，通過(guò)制麥和糖化將大分子物質(zhì)水解成酵母可以吸收利用的碳、氮源及其他營(yíng)養(yǎng)組分，其含量和組成直接影響酵母的生理狀態(tài)、發(fā)酵過(guò)程的釀造性能，乃至最終產(chǎn)品風(fēng)味的一致性。目前，隨著生產(chǎn)過(guò)程其他環(huán)節(jié)工藝控制水平的越來(lái)越高，全球原料采購(gòu)帶來(lái)的質(zhì)量波動(dòng)成為制約風(fēng)味一致性控制的關(guān)鍵。現(xiàn)有的配方技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了碳、氮水平及比例的合理控制，但酵母的發(fā)酵性能和啤酒風(fēng)味仍存在波動(dòng)，究其本質(zhì)是碳、氮源組分，尤其是參與啤酒風(fēng)味代謝的麥汁氨基酸譜不一致導(dǎo)致。麥汁中含有除了半胱氨酸之外的19種基本氨基酸。在發(fā)酵過(guò)程中，氨基酸為酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)提供氮源，氨基酸的碳骨架參與酵母細(xì)胞中其他氨基酸、蛋白質(zhì)及酶的生物合成，以及啤酒風(fēng)味物質(zhì)的形成[6-9]。

前期已經(jīng)通過(guò)人為配制不同氨基酸組成的合成培養(yǎng)基在相同條件下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究了培養(yǎng)基中影響酵母發(fā)酵性能及醇酯風(fēng)味形成的4種關(guān)鍵氨基酸：谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）和賴(lài)氨酸（Lys）[10]。作者在前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)麥汁的現(xiàn)狀，通過(guò)關(guān)鍵氨基酸添加的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究關(guān)鍵氨基酸對(duì)酵母生長(zhǎng)、風(fēng)味物質(zhì)代謝的影響。明確麥汁中影響Lager酵母發(fā)酵性能的關(guān)鍵氨基酸及其作用，為深入研究啤酒風(fēng)味一致性提供技術(shù)保障，也為大麥品種及原料配方（種類(lèi)和比例）的替換提供技術(shù)支持，同時(shí)為麥芽質(zhì)量控制、配方技術(shù)和育種提供新的研究方向和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌株Lager酵母菌株Saccharomyces pasorianusTT-1：青島啤酒廠。

主要試劑酵母培養(yǎng)基（YPD）、酵母無(wú)氨基氮源基礎(chǔ)（YNB）、20種氨基酸及 K2HPO4：北京索萊寶科技有限公司；麥芽三糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；17AA氨基酸水解標(biāo)樣（2.5 mmol/L）、硼酸緩沖液、衍生劑粉末 2A、衍生劑稀釋液 2B：美國(guó) Waters公司；色氨酸、三水乙酸鈉、三乙胺：瑞士Fluka公司；乙腈（UV級(jí)）：美國(guó)Burdick&Jackson公司；95%乙醇：南京試劑股份有限公司；雙乙酰、戊二酮、乙醛和醇酯標(biāo)準(zhǔn)樣：德國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

EBC管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1）生產(chǎn)廠取回收酵母，轉(zhuǎn)移至50 mL滅菌離心管后4 000 r/min離心10 min，棄上清液及表面酵母層。

2）稱(chēng)取 1.1 g 酵母（2×107個(gè)）裝入滅菌離心管中，分別取培養(yǎng)基混合均勻。

3）將離心管中酵母加入含有220 mL麥汁（或培養(yǎng)基）的Scott瓶中，混勻，加入1滴消泡劑。

4）Scott瓶充氧，左右搖晃20次，放氣，重復(fù)2次。

5）Scott瓶中培養(yǎng)基及酵母轉(zhuǎn)入EBC管，開(kāi)始發(fā)酵（12℃）。

6）10 d后發(fā)酵結(jié)束進(jìn)行相應(yīng)理化指標(biāo)的分析。

關(guān)鍵氨基酸添加的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1）合成培養(yǎng)基的關(guān)鍵氨基酸添加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：根據(jù)工業(yè)生產(chǎn)13°P麥汁的糖譜及氨基酸譜，進(jìn)行合成培養(yǎng)基的配制，見(jiàn)表1，并用20%乳酸調(diào)至pH 5.4。在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上增加或減少4種關(guān)鍵氨基酸，并在相同條件下進(jìn)行EBC管發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 合成培養(yǎng)基的配制Table 1 Formulation of synthetic medium

Glu調(diào)整：從64 mg/L增加到138 mg/L；Pro調(diào)整：從383 mg/L增加到417 mg/L；Lys調(diào)整：從93 mg/L降低到71 mg/L；Val調(diào)整：從125 mg/L降低到110 mg/L。

2）工業(yè)生產(chǎn)麥汁的關(guān)鍵氨基酸添加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：在工業(yè)生廠麥汁的基礎(chǔ)上進(jìn)行關(guān)鍵氨基酸的添加（30 mg/L Glu、50 mg/L Pro、25 mg/L Val和 20 mg/L Lys），并在相同條件下進(jìn)行EBC管發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

酵母細(xì)胞數(shù)檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中懸浮酵母細(xì)胞數(shù)的測(cè)定采用Countstar?自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。

麥汁氨基酸組分檢測(cè)采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前衍生，通過(guò)梯度洗脫，紫外和熒光雙檢測(cè)器串聯(lián)檢測(cè)[11]。

啤酒風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)使用氣相色譜儀Clarus 500 GC及頂空進(jìn)樣器TurboMatrix 40對(duì)雙乙酰、乙醛、醇酯風(fēng)味物質(zhì)（正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、己酸乙酯）進(jìn)行檢測(cè)[12]。頂空進(jìn)樣設(shè)置：爐溫60℃，加熱時(shí)間40 min，傳輸線溫度110℃，取樣針110℃，載氣25 psi。氣相色譜設(shè)置：起始溫度50℃，保持3 min；以30℃/min程序升溫至180℃，保持3 min；載氣為氮?dú)?，流設(shè)為 15 psi，氫氣流量 45 mL/min，空氣流量 450 mL/min。檢測(cè)器設(shè)置：氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）溫度250℃；進(jìn)樣溫度150℃。

基于反相高效液相色譜，采用乙腈和0.01%三氟乙酸的水溶液作為流動(dòng)相，梯度洗脫，在Atlantis C18色譜柱上，210 nm紫外檢測(cè)，定量檢測(cè)啤酒中芳香醇（酪醇、β-苯乙醇和色醇）的含量[13]。

數(shù)據(jù)分析每個(gè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值，采用IBM SPSS Statistics 22軟件中單因素ANOVA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成培養(yǎng)基中關(guān)鍵氨基酸添加/減少的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

通過(guò)在合成培養(yǎng)基中增加谷氨酸和脯氨酸的質(zhì)量濃度，各氨基酸的終質(zhì)量濃度符合工廠麥汁的含量。并檢測(cè)谷氨酸和脯氨酸增加對(duì)酵母增殖及醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響。

結(jié)果表明，提高谷氨酸和脯氨酸的質(zhì)量濃度均會(huì)抑制發(fā)酵過(guò)程中酵母的增殖，見(jiàn)圖1，顯著降低發(fā)酵過(guò)程的峰值酵母數(shù)；此外，二者的質(zhì)量濃度還會(huì)抑制發(fā)酵過(guò)程中芳香醇的生成，與脯氨酸相比，谷氨酸的抑制作用更加顯著（p＜0.05）；但增加這兩種氨基酸的質(zhì)量濃度對(duì)于醇酯的生成無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖2。

通過(guò)在合成培養(yǎng)基中降低纈氨酸和賴(lài)氨酸的質(zhì)量濃度，并檢測(cè)纈氨酸和賴(lài)氨酸降低對(duì)酵母增殖及醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響。

圖1 提高谷氨酸和脯氨酸質(zhì)量濃度對(duì)酵母增殖的影響Fig.1 Influence of glutamate acid and proline addition on yeast growth

圖2 提高谷氨酸和脯氨酸質(zhì)量濃度對(duì)醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響Fig.2 Influence of glutamate acid and proline addition on flavor generation

結(jié)果表明，降低纈氨酸和賴(lài)氨酸的質(zhì)量濃度均會(huì)抑制發(fā)酵過(guò)程中酵母的增殖，見(jiàn)圖3。降低賴(lài)氨酸質(zhì)量濃度會(huì)顯著促進(jìn)β-苯乙醇的生成并抑制酪醇的生成（p＜0.05），但對(duì)高級(jí)醇及酯類(lèi)的生成無(wú)顯著影響。降低纈氨酸質(zhì)量濃度，會(huì)顯著抑制高級(jí)醇及芳香醇的生成（p＜0.05），對(duì)酯類(lèi)生成無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖4。

從關(guān)鍵氨基酸添加/減少的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，谷氨酸/脯氨酸與纈氨酸/賴(lài)氨酸對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酵母增殖的影響有所不同。推測(cè)谷氨酸/脯氨酸可能通過(guò)抑制酵母對(duì)麥汁氨基酸的吸收從而抑制酵母增殖，而纈氨酸/賴(lài)氨酸作為酵母的偏好性氮源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了酵母的增殖[10，14]。圖4中關(guān)鍵氨基酸中除了纈氨酸對(duì)高級(jí)醇生成的正調(diào)控作用外，其余氨基酸質(zhì)量濃度的波動(dòng)對(duì)高級(jí)醇及酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的生成均無(wú)顯著影響。纈氨酸對(duì)高級(jí)醇生成的促進(jìn)作用與纈氨酸直接參與Ehrlich途徑并形成高級(jí)醇有關(guān)[15]。研究表明，苯丙氨酸和酪氨酸分別參與了β-苯乙醇和酪醇的代謝[16]，而關(guān)于谷氨酸、纈氨酸和賴(lài)氨酸對(duì)芳香醇生成的影響卻未見(jiàn)報(bào)道。分析原因可能與酵母對(duì)這3種關(guān)鍵氨基酸及苯丙氨酸/酪氨酸吸收的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用有關(guān)。

圖3 降低纈氨酸和賴(lài)氨酸質(zhì)量濃度對(duì)酵母增殖的影響Fig.3 Influence of valine and lysine reduction on yeast growth

圖4 降低纈氨酸和賴(lài)氨酸質(zhì)量濃度對(duì)醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響Fig.4 Influence of valine and lysine reduction on flavor generation

2.2 工業(yè)生產(chǎn)麥汁的關(guān)鍵氨基酸添加發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

為研究關(guān)鍵氨基酸質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，是否會(huì)對(duì)酵母的發(fā)酵性能及風(fēng)味物質(zhì)的生成產(chǎn)生影響，取工業(yè)生產(chǎn)麥汁 （營(yíng)養(yǎng)充足），分別添加4種關(guān)鍵氨基酸，進(jìn)行EBC管發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。麥汁的氨基酸譜情況見(jiàn)表2。

表2 工業(yè)生產(chǎn)麥汁氨基酸譜Table 2 Amino acids profile of the brewery wort

通過(guò)在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中增加谷氨酸和脯氨酸的質(zhì)量濃度，并檢測(cè)谷氨酸和脯氨酸過(guò)量對(duì)酵母增殖及醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響。

結(jié)果表明，添加谷氨酸和脯氨酸會(huì)顯著抑制酵母增殖（見(jiàn)圖5），導(dǎo)致峰值酵母數(shù)降低。但兩者對(duì)發(fā)酵后期懸浮酵母數(shù)的影響不同：谷氨酸會(huì)促進(jìn)發(fā)酵后期酵母的沉降，而脯氨酸會(huì)抑制發(fā)酵后期酵母的沉降（p＜0.05）。除添加谷氨酸對(duì)β-苯乙醇的顯著抑制作用外（p＜0.05），這兩種氨基酸對(duì)醇酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的生成無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖6。該結(jié)果與上述利用合成培養(yǎng)基進(jìn)行的關(guān)鍵氨基酸調(diào)整的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 麥汁添加谷氨酸和脯氨酸對(duì)酵母增殖的影響Fig.5 Influence of glutamate acid and proline addition in wort on yeast growth

在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中增加賴(lài)氨酸和纈氨酸的質(zhì)量濃度，并檢測(cè)賴(lài)氨酸和纈氨酸過(guò)量對(duì)酵母增殖及醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響。結(jié)果表明，在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中添加賴(lài)氨酸對(duì)酵母增殖有顯著促進(jìn)作用，而纈氨酸的作用不明顯，見(jiàn)圖7。添加纈氨酸顯著促進(jìn)異丁醇的生成；酪醇的生成受到賴(lài)氨酸的抑制（p＜0.05）；這兩種氨基酸對(duì)酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的生成無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖8。

圖6 麥汁添加谷氨酸和脯氨酸對(duì)醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響Fig.6 Influence of glutamate acid and proline addition in wort on flavor generation

關(guān)鍵氨基酸在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中質(zhì)量濃度的波動(dòng)對(duì)酵母增殖及醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響與上述利用合成培養(yǎng)基進(jìn)行的關(guān)鍵氨基酸質(zhì)量濃度調(diào)整的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。但在工業(yè)生產(chǎn)麥汁中添加纈氨酸對(duì)酵母增殖無(wú)顯著影響，且其對(duì)芳香醇生成的抑制作用也不顯著，推測(cè)這可能與工業(yè)生產(chǎn)麥汁的營(yíng)養(yǎng)成分的復(fù)雜性有關(guān)。

圖7 麥汁添加纈氨酸和賴(lài)氨酸對(duì)酵母增殖的影響Fig.7 Influence of valine and lysine addition in wort on yeast growth

圖8 麥汁添加纈氨酸和賴(lài)氨酸對(duì)醇酯風(fēng)味物質(zhì)生成的影響Fig.8 Influence of valine and lysine addition in wort on flavor generation

3 結(jié) 語(yǔ)

麥汁營(yíng)養(yǎng)組分（主要包括碳源和氮源）直接影響酵母的生理狀態(tài)、發(fā)酵性能及風(fēng)味物質(zhì)代謝?，F(xiàn)有的啤酒釀造技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了碳源的合理控制，但酵母的發(fā)酵性能、啤酒風(fēng)味特征的典型性和一致性仍難以達(dá)到精準(zhǔn)控制，究其本質(zhì)是參與風(fēng)味物質(zhì)代謝的氮源尤其是氨基酸質(zhì)量濃度與比例的差異性導(dǎo)致。

麥汁關(guān)鍵氨基酸對(duì)于工廠麥汁氮源組分的控制非常重要。通過(guò)關(guān)鍵氨基酸添加實(shí)驗(yàn)確定了關(guān)鍵氨基酸對(duì)酵母生長(zhǎng)、風(fēng)味代謝的作用：其中谷氨酸和脯氨酸抑制酵母增殖；纈氨酸會(huì)促進(jìn)高級(jí)醇的生成；賴(lài)氨酸會(huì)促進(jìn)酵母的增殖。對(duì)麥汁中關(guān)鍵氨基酸在Lager酵母發(fā)酵過(guò)程中的作用機(jī)制的明晰，能夠?yàn)長(zhǎng)ager啤酒釀造的氮源優(yōu)化提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。