田亞珍， 武國凡， 秦緒軍， 牛世全， 孔維寶*

（1.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州，730070；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 預(yù)防醫(yī)學(xué)院，陜西 西安，710032）

淀粉是高等植物合成的具有重要功能的碳水化合物之一，并且是一種廉價(jià)易得的可再生性資源，已成為很多生產(chǎn)領(lǐng)域的重要原料[1]。淀粉作為植物中能量儲(chǔ)存分子以及許多動(dòng)物基本能量的來源[2]，其合成主要發(fā)生在兩個(gè)階段，一是在形成臨時(shí)淀粉的光合作用階段，另一個(gè)則是在成為貯藏淀粉的營養(yǎng)積累階段[3]。淀粉的生物合成包括兩種形式：在光合組織葉綠體中進(jìn)行的瞬時(shí)淀粉合成和在非光合組織造粉體中完成的貯藏淀粉合成，淀粉合成酶是淀粉生物合成途徑中關(guān)鍵的酶[4]。淀粉合成酶（Starch Synthase，SS，EC 2.4.1.21 ）是一個(gè)葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)延伸直鏈淀粉和直鏈淀粉的葡萄糖鏈，通過轉(zhuǎn)移ADP葡萄糖的糖基到α-1，4葡萄糖的非還原性末端來延長α-1，4葡萄糖多聚體[5]，多聚體又作為淀粉分支酶的底物合成支鏈淀粉[6]。生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中形成的建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的以計(jì)算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的新興科學(xué)，它以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為主要手段，對原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行儲(chǔ)存、管理、注釋、加工，通過查詢、搜索、比對分析，從而預(yù)測其分子的結(jié)構(gòu)與功能及其兩者間的相互作用關(guān)系[7]。

作者用生物信息學(xué)的方法對馬鈴薯、紅薯等6種重要農(nóng)作物的SS基因及相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)而對其理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行預(yù)測分析，以期為今后開展SS的深入研究和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

馬鈴薯 （Solanum tuberosum）、 紅薯（Impomoea batatas）、 小麥 （Triticum aestivum）、 高粱（Sorghum bicolor）、 南瓜 （Cucurbita moschata） 、 水稻（Oryza sativa）SS mRNA序列和氨基酸序列來源于NCBI的基因數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址見表1[8]。登錄號分別為：X52417.1、U44126.1、D10657.1、U41446.1、JN828808.1和FJ750946.1。

表1 生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫和軟件的相關(guān)網(wǎng)址Table 1 Websites of bioinformatics database and software

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過NCBI網(wǎng)站檢索合適的DNA序列，在選擇基因序列的時(shí)候選擇完整的線性序列。利用CpG島分析6種物種的甲基化位點(diǎn)；通過DNAstar程序中的EditSeq確定其完整編碼框并預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；通過ProtScale程序分析蛋白質(zhì)的親水性/疏水性；通過在線工具TMHMM 2.0 Server分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；通過PSIPRED網(wǎng)站的在線分析功能完成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；利用Smart分析物種的結(jié)構(gòu)域；利用Blast完成核酸及氨基酸序列的同源性比對；利用Mega 6.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種植物SS甲基化位點(diǎn)分析

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑之一，是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團(tuán)共價(jià)到CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位上的過程[9]?；騿?dòng)子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG甲基化是眾多基因?qū)崿F(xiàn)去表達(dá) （沉默）和基因印記的重要途徑，通過測定啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)了解基因是否去表達(dá)，為研究基因表達(dá)提供了DNA水平進(jìn)行的途徑[10]。DNA相關(guān)區(qū)域的每個(gè)CpG位點(diǎn)有特異性的甲基化修飾，導(dǎo)致復(fù)雜的信息類型，形成特異性CpG甲基化譜[11]。CpG島的甲基化是表觀遺傳中基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制。通過CpG島分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)[12]，紅薯、小麥、高粱和水稻都含有甲基化位點(diǎn)，馬鈴薯和南瓜不含甲基化位點(diǎn)。紅薯含有3個(gè)甲基化位點(diǎn)，小麥含有701個(gè)甲基化位點(diǎn)，高粱含有154個(gè)甲基化位點(diǎn)，水稻含有1 799個(gè)甲基化位點(diǎn)。

2.2 SS一級結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 核苷酸及其對應(yīng)的氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)分析用 DNAstar，ORF Finder和ProtParam分析馬鈴薯、紅薯、小麥、高粱、南瓜、水稻6種植物相關(guān)基因序列，對基因的核苷酸及其對應(yīng)的氨基酸序列的組成成分和理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。淀粉合成酶核苷酸序列的全長平均為1 847 bp，開放閱讀框的長度約為877 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子有TAA、TGA、GAC。開放閱讀框所編碼的氨基酸殘基平均數(shù)286；平均相對分子質(zhì)量為31 915.88；平均等電點(diǎn)為 8.264 5；pH為7的中性溶液中平均帶電荷為-0.598 1；平均親水氨基酸 63個(gè)，平均疏水氨基酸 102個(gè)，預(yù)測SS為疏水性蛋白。

表2 不同植物中SS組成成分及理化性質(zhì)分析Table 2 Composition analysis and physicochemical characteristics of SS in different plants

2.2.2 SS氨基酸疏水性/親水性分析蛋白質(zhì)疏水性/親水性的組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力。蛋白質(zhì)折疊會(huì)形成親水內(nèi)核和親水表面，同時(shí)在潛在跨膜區(qū)形成高疏水值區(qū)域，據(jù)此可以推測跨膜二級螺旋等二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)表面氨基酸分布。分析正值越大表示越疏水，負(fù)值越大表示越親水，而介于-0.5～+0.5之間的主要為兩性氨基酸[13]。用ProtScale對馬鈴薯等6種植物淀粉合成酶氨基酸序列進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測，結(jié)果見圖1。預(yù)測結(jié)果表明，馬鈴薯SS多肽鏈中的氨基酸（異亮氨酸，ILE）具有最高的分值（2.111）位于第130、131位，表明該位點(diǎn)的氨基酸疏水性最強(qiáng)，而氨基酸（精氨酸，Arg）的分值最低（-0.667）位于第 1145、1146位，表明該位點(diǎn)的氨基酸親水性最強(qiáng)。而就整體來看，疏水性氨基酸多于親水性氨基酸。因此，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，可認(rèn)為馬鈴薯SS是疏水性蛋白。另外對其它5種物種的SS氨基酸序列進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測，結(jié)果表明其均為疏水性蛋白。SS整條鏈表現(xiàn)為疏水性，這與前面的預(yù)測結(jié)果一致，即表明SS為疏水性蛋白。

圖1 馬鈴薯SS疏水性/親水性預(yù)測分析Fig.1 Predictive analysis of hydrophobic/hydrophili of Ipomoea batatas SS

2.2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測和分析跨膜結(jié)構(gòu)域是膜內(nèi)在蛋白和膜脂相結(jié)合的主要部位，它可能作為膜受體起作用，也可能定位于膜的錨定蛋白或者離子通道蛋白等[14]。因而，預(yù)測和分析跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)τ诹私獾鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及在細(xì)胞中的作用部位具有十分重要的意義。使用TMHMM 2.0 Server對馬鈴薯等6種植物的SS氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測和分析，判定其跨膜結(jié)構(gòu)域，紅薯和水稻的預(yù)測結(jié)果見圖2。紅薯和水稻這兩種SS序列都含有結(jié)構(gòu)域，馬鈴薯、小麥、高粱、南瓜4種均沒有結(jié)構(gòu)域。

2.3 淀粉合成酶二級結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)元件組成蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)指它的多肽主鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)分子的多肽鏈通常折疊和盤曲成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，以形成特有的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)[15]。因此，預(yù)測和分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)對了解其功能和空間結(jié)構(gòu)有重要意義。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組學(xué)研究的重點(diǎn)問題之一[16]。

目前預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的方法有很多，但是準(zhǔn)確率卻不是很理想。目前的預(yù)測方法中，PSlPRED方法的預(yù)測結(jié)果比較理想，因此采用此方案。常見的二級結(jié)構(gòu)元件主要有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊片、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等[17]。表3為PSlPRED法預(yù)測6種植物SS氨基酸的二級結(jié)構(gòu)原件比例，結(jié)果顯示其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主要構(gòu)件。圖3高粱SS氨基酸的二級結(jié)構(gòu)為：α-螺旋含有22個(gè)，分別在53～64、97～106等區(qū)域其所占蛋白質(zhì)比例為13.33%。 β-折疊片含有 29 個(gè)，分別在 5～15、19～23、86～90、116～121、161～162 等區(qū)域，所占蛋白質(zhì)比例17.58%。無規(guī)則卷曲和延伸鏈含有114個(gè)，分別在1 ～4、16 ～18、24 ～52、65 ～85、91 ～96、107 ～115、122 ～160、163～165等區(qū)域，所占蛋白質(zhì)比例為69.09%。

表3 SS蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of SS protein secondary stucture

圖3 高粱SS二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of secondary structure of Sorghum Bicolor SS

2.3.2 結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)構(gòu)域是一種相對獨(dú)立的區(qū)域性的結(jié)構(gòu)，是介于二級和三級結(jié)構(gòu)之間的另一種層次結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)亞基中的緊密球狀結(jié)構(gòu)區(qū)域，在蛋白質(zhì)中起著獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位、功能單位與折疊單位的功能。一個(gè)蛋白質(zhì)可以包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域也可以由幾個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成功能單位，通過Smart對6種植物的SS結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。對紅薯和水稻SS結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果見圖4，其中紅色小方塊表示低復(fù)雜度區(qū)域。紅薯SS預(yù)測結(jié)果表明，其低度復(fù)雜區(qū)位于98～115處，長度為17 bp。對水稻SS結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果表明其含有兩個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域，其低復(fù)雜度區(qū)域位于2～14處和99～108處，總長度為21 bp。其余4種植物SS均不含有結(jié)構(gòu)域。

圖4 紅薯和水稻SS的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Prediction of structural domain of SS in Impomoea batata and Oryza sativa

2.4 核酸及蛋白質(zhì)序列的比對分析

序列的相似性與序列的同源性有一定關(guān)系，一般來說，序列間的相似性越高，它們是同源序列的可能性就越高，所以通常通過序列的相似性推測序列是否同源。用Blast程序分別對6種物種的SS核酸（Blastn）及蛋白質(zhì)序列（Blastp）進(jìn)行同源性比對，結(jié)果見表4。表4數(shù)據(jù)顯示，南瓜與高粱的核酸序列同源度分別為74%，其他物種均無同源序列。

表4 6種植物間核酸序列的相關(guān)性比對Table 4 Correlation of nucleotides sequences between six different plants

Blastp比對5種植物蛋白質(zhì)序列的同源性，結(jié)果見表5。水稻與小麥、高粱的同源度分別為86%、87%。南瓜與高粱的同源度分別為82%，高粱與小麥的同源度為64%。

表5 5種植物間蛋白質(zhì)序列的相關(guān)性比對Table 5 Correlation between protein sequences of five different plants

Blastn與Blastp的結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，核酸的同源度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于蛋白質(zhì)的同源度，這是因?yàn)槊艽a子的簡并性即由一種以上的密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象，對應(yīng)于同一氨基酸的密碼子又稱為同義密碼子[18]。Blastp比對結(jié)果顯示：紅薯與歐洲山楊（Populustremula，CAI77773.1）、 抗 寒 性 煙 草（Nicotiana sylvestris，XP009777240.1）、 柑橘（Citrus clementinal，XP 006441435.1）、 葡 萄 （Vitis vinifera，CAN63617.1）、 可 可 （Theobromacacao，XP 0070029360.1）的同源度分別為 37%、33%、36%、32%、32%。 小 麥 與 高 粱 （Sorghum bicolor，KXG39419.1）、 節(jié) 節(jié) 麥 （Aeqilopstauschii，EMT23342.1）、 大 麥 （Hordeumvulqare，AAA32972.1）、 秈 稻 （Oryza sativaindica group，EEC82681.1）、小米（Setaria italica，XP004958680.1）同源度分別為 64%、92%、71%、64%、87%。高粱與玉米 （Zea mays，NP 001149266.1）、 秈 稻 （Oryza sativaindica group，EAZ09149.1）、 小 麥 （Triticum monococcum，AHJ14569.1）、大葉藻（Zostera marina，KMZ64620.1）、葡 萄 （Vitis vinifera，CAN76946.1）的同源度分別 89%、85%、71%、88%、57%。南瓜與西瓜 （Citrullus lanatus，AEV46188.1）、 草莓（Fragaria ananassa，AAT40976.1）、 山 荊 子 （Malus baccata，AED99204.1）、刺梨（Rosa roxburghii，AAT28434.1）、山葡萄（Vitis amurensis，AAR08831.1）的同源度分別為 83%、46%、45%、48%、45%。 水稻與小米（Setaria italica，XP 004977081.1）、 玉 米 （Zea mays，NP 001105759.1）、 小 麥 （Triticumaestivum，CBG91898.1） 、 高 粱 （Sorghumbicolor，XP 002455594.1）、 毛 果 楊 （Populus trichocarpa，XP 002320314.1）的同源度分別為 90%、86%、86%、87%、77%。

2.5 進(jìn)化樹構(gòu)建與分析

用MEGA 6.0[19]軟件分析淀粉合成酶的6個(gè)物種之間的親緣關(guān)系并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，參與分析的6個(gè)物種在進(jìn)化樹上呈現(xiàn)出一個(gè)大的分支：小麥和高梁SS進(jìn)化程度相似，和水稻進(jìn)化程度接近，和南瓜的進(jìn)化相距較遠(yuǎn)。其中南瓜和馬鈴薯、紅薯進(jìn)化程度相近。6個(gè)物種之間呈現(xiàn)明顯的親緣關(guān)系。

圖5 淀粉合成酶進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of SS

3 結(jié)語

紅薯、小麥、高粱和水稻都含有甲基化位點(diǎn)，馬鈴薯和南瓜不含甲基化位點(diǎn)。紅薯含有3個(gè)甲基化位點(diǎn)，小麥含有701個(gè)甲基化位點(diǎn)，高粱含有154個(gè)甲基化位點(diǎn)，水稻含有1 799個(gè)甲基化位點(diǎn)。

淀粉合成酶核苷酸序列的全長平均為1 847 bp，開放閱讀框的長度約為877 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子有TAA、TGA、GAC。開放閱讀框所編碼的氨基酸殘基平均數(shù)286，平均相對分子質(zhì)量為31 915.88；平均等電點(diǎn)為 8.264 5，pH為7的中性溶液中平均帶電荷為-0.598 1。平均親水氨基酸63個(gè)，平均疏水氨基酸 102個(gè)，預(yù)測SS為疏水性蛋白。

淀粉合成酶為疏水性蛋白，小麥和水稻分別存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。6種植物淀粉合成酶的二級結(jié)構(gòu)表明，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主要構(gòu)件。Blastn比對6種物種的同源性，結(jié)果表明，南瓜與高粱的同源度分別為74%，其他物種均無同源序列。Blastp比對5種植物蛋白質(zhì)的同源性表明，水稻與小麥、高粱的同源度分別為86%、87%。南瓜與高粱的同源度分別為82%，高粱與小麥的同源度為64%。通過進(jìn)化樹分析淀粉合成酶顯示，小麥和高梁進(jìn)化程度相似，和南瓜的進(jìn)化相距較遠(yuǎn)。這可能與淀粉合成酶在不同物種上進(jìn)化程度有關(guān)。