宋增健，薛 松，王向東，林 劍*

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264000；2.山東大學 應(yīng)用生命科學研究院，山東 濟南 250000）

自從1907年Nicolle發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中含有溶解因子開始，溶菌酶漸漸進入人們的視野[1]。作為一種抗菌劑，它可以切斷細胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵，破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)，使菌體在滲透壓作用下裂解死亡[2]。由于溶菌酶特殊的抑菌機理，不會使細菌產(chǎn)生抗藥性，從而可以緩解日益嚴重的抗生素濫用問題[3]；作為一種天然、安全的抗菌劑，溶菌酶廣泛的應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)[4]，市場前景廣闊。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）食品添加劑協(xié)會在1992年公布：溶菌酶應(yīng)用在食品工業(yè)中是安全、無害的；2010年，我國衛(wèi)生部第23號公告中，批準溶菌酶可以作為添加劑應(yīng)用在食品中[5]。目前，國內(nèi)市場上應(yīng)用的溶菌酶主要是從雞蛋清中分離提取，原料成本高，限制了蛋清溶菌酶的廣泛應(yīng)用[6]。因此，采用其他方法提高蛋清溶菌酶表達量非常具有研究價值。

巴斯德畢赤氏酵母（Pichia pastoris）作為一種高效、穩(wěn)定的外源蛋白表達系統(tǒng)，具有操作簡易、遺傳穩(wěn)定性高、胞外蛋白表達量相對較高等優(yōu)點，在外源基因表達領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7-10]。巴斯德畢赤氏酵母作為外源基因表達的載體，自身分泌的雜蛋白較少，分離純化成本降低[11]。目前，國內(nèi)關(guān)于基因重組溶菌酶發(fā)酵條件的研究還處于探索階段，朱德偉[12]利用畢赤氏酵母（P.pastoris）表達基因重組溶菌酶，最高產(chǎn)量僅有166.9 mg/L，與國外MASUDA T等[13]報道的最高表達量400 mg/L相差巨大。除了菌種構(gòu)建的問題，培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化對最終的表達結(jié)果也有很大的影響[14]。因此，優(yōu)化蛋清溶菌酶的表達條件，對提高目的蛋白的表達量有重要的意義。

本研究采用山東大學構(gòu)建的一株甲醇誘導型蛋清溶菌酶基因重組畢赤酵母NCY-2為研究對象。孫瑋遙等[15]曾在搖床水平對其進行了較為系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果表明，在最佳表達條件下，搖床水平最高酶表達量為775 U/mL。雖然比優(yōu)化之前提高了2.2倍，取得了一定的研究成果，但是該發(fā)酵水平尚達不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，本研究在孫瑋遙等[15]的基礎(chǔ)上，采用廉價且營養(yǎng)豐富的麥芽汁為培養(yǎng)基[16]。在搖瓶水平上優(yōu)化菌株NCY-2生長和表達條件，以期進一步提高搖床水平發(fā)酵液中蛋清溶菌酶酶活力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

甲醇誘導型蛋清溶菌酶基因重組畢赤氏酵母（Pichia pastoris）NCY-2：山東大學應(yīng)用生命科學研究中心構(gòu)建，本實驗室保存。

1.1.2 材料

麥芽：澳大利亞大麥芽。

原麥芽汁：本實驗室制備，麥芽汁制備工藝見1.3.2。主要成分為還原糖（80±2）g/L、α-氨基酸態(tài)氮（500±5）mg/L。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L。pH自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：將原麥芽汁與水按體積比1∶1稀釋，制成種子培養(yǎng)基。

生長培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑

溶菌酶測試盒（30T/28樣）：南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

100 L四器糖化設(shè)備：山東中德啤酒設(shè)備有限公司；G180TW全自動高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPH-2102B恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

配制種子培養(yǎng)基于500 mL錐形瓶中，裝液量為20%，115℃滅菌30 min，冷卻至室溫接種，在30℃、200 r/mim的恒溫振蕩培養(yǎng)器中搖瓶培養(yǎng)24 h。

1.3.2 麥芽汁糖化工藝

糖化：全麥芽糖化，不添加任何輔料，料液比1∶4（g∶mL），采用兩段浸出糖化法[17]。

1.3.3 普通錐形瓶與擋板錐形瓶對比

將原麥芽汁∶水=1∶1稀釋后，分裝于500 mL普通錐形瓶和500 mL擋板錐形瓶（內(nèi)含擋板，混合效果更好，更有利于氧氣的傳遞）中，115℃滅菌30 min冷卻至室溫接種，搖瓶培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)條件：溫度30℃，pH值5.0，轉(zhuǎn)速200 r/mim，裝液量20%。

1.3.4 原麥芽汁稀釋度的確定

將原麥芽汁與水的體積比分別按1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進行稀釋，制成麥芽汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同1.3.3所述，在恒溫振蕩器中搖瓶培養(yǎng)24 h，檢測菌體生長情況，確定原麥芽汁的最優(yōu)稀釋度。

1.3.5 外加氮源對菌株NCY-2的影響

以（NH4）2SO4和尿素為外加氮源，含量分別為：0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L，原麥芽汁與水的體積比為1∶1，培養(yǎng)條件按1.3.3所述，在恒溫振蕩器中搖瓶培養(yǎng)24 h，檢測菌體生長情況，確定合適的外加氮源及其含量。

1.3.6 菌株NCY-2培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果，結(jié)合大量的文獻資料[18-21]確定了溫度、pH值、轉(zhuǎn)速以及接種量的優(yōu)化范圍，以菌體濃度（Y）為考察指標，設(shè)計了U5（54）的均勻設(shè)計試驗，設(shè)計方案如表1所示。

表1 菌株NCY-2發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻設(shè)計試驗方案Table 1 Design of uniform experiments for strain NCY-2 fermentation technology optimization

1.3.7 甲醇添加方式對菌株NCY-2的影響

結(jié)合孫瑋遙等[15]甲醇單因素試驗以及參考大量文獻[22-25]確定了甲醇的添加方式為定量添加、遞增添加、倒序添加。菌株NCY-2按照1.3.6最優(yōu)條件，于恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)24h進行表達，表達條件：溫度20℃，pH 4.0，轉(zhuǎn)速200 r/mim，甲醇添加方式及添加量按表2所示。

表2 甲醇添加方式試驗方案Table 2 Experimental scheme of methanol addition mode

1.3.8 菌株NCY-2表達條件優(yōu)化

根據(jù)菌株NCY-2在麥芽汁培養(yǎng)基的培養(yǎng)情況，結(jié)合孫瑋遙等[15]的研究數(shù)據(jù)，按照1.3.6最優(yōu)條件進行恒溫振蕩培養(yǎng)24 h進行表達，甲醇添加方式按照1.3.7最優(yōu)結(jié)果，以發(fā)酵液中蛋清溶菌酶酶活力（E）為考察指標，設(shè)計了U5（54）均勻設(shè)計試驗，設(shè)計方案如表3所示。

表3 菌株NCY-2表達條件優(yōu)化均勻試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of uniform experiments for strain NCY-2 expression condition optimization

1.3.9 檢測及數(shù)據(jù)處理方法

麥芽汁中還原糖的檢測：廉愛農(nóng)法[26]。

麥芽汁中α-氨基氮的檢測：茚三酮顯色法[27]。

發(fā)酵液中溶菌酶酶活力檢測：發(fā)酵液離心，取上清液，以溶壁微球菌為底物，37℃水浴中反應(yīng)15 min，于波長530 nm處測定吸光度值的變化值，以蒸餾水為空白對照，以溶菌酶標準品（200 U/mL）為參考，溶菌酶酶活力計算公式如下：

每組實驗重復3次，數(shù)據(jù)采用DPS、Microsoft Excel分析，采用Origin 8.5.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通錐形瓶與擋板錐形瓶對比

菌株NCY-2在其生長和誘導過程中強烈需氧，發(fā)酵液中的溶氧濃度是影響菌體生長和產(chǎn)物表達的一個重要因素[28]。普通錐形瓶與擋板錐形瓶對菌株NCY-2菌體濃度的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 普通錐形瓶與擋板錐形瓶發(fā)酵結(jié)果對比Fig.1 Comparison of fermentation results by conical bottle and baffle cone bottle

由圖1可知，擋板錐形瓶的菌體濃度是普通錐形瓶的1.67倍，前者菌體濃度最高可達4.0×108個/mL，比普通錐形瓶更適合菌體生長。因此，選用擋板錐形瓶進行試驗。

2.2 原麥芽汁稀釋度對菌株NCY-2的影響

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及其含量對菌株生長至關(guān)重要。為避免稀釋度過低造成原料浪費，增加發(fā)酵成本；稀釋度過高，菌體的生長得不到滿足，本研究針對原麥芽汁的稀釋度進行了探索。原麥芽汁稀釋度對菌株NCY-2菌體濃度的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 原麥芽汁稀釋度對菌株NCY-2生長的影響Fig.2 Effect of the dilution of original wort on strain NCY-2 growth

由圖2可知，原麥芽汁∶水=1∶1時，菌體長勢最好，菌體濃度最高可達4.01×108個/mL，是原麥芽汁∶水=1∶2的1.60倍，隨著稀釋倍數(shù)的增大，發(fā)酵液中的菌體濃度對數(shù)值減小，所以菌體濃度降低。全麥芽培養(yǎng)基培養(yǎng)時，菌體濃度只有2.14×108個/mL，是最高值的53%。因為此時發(fā)酵液中還原糖含量較高，發(fā)酵過程中次級代謝產(chǎn)物較多，抑制了菌體的生長。在保證菌株NCY-2生長的前提下，最大程度的節(jié)省發(fā)酵成本，因此確定原麥芽汁稀釋度為1。

2.3 外加氮源對菌株NCY-2的影響

外加氮源的種類及其含量對菌株NCY-2菌體濃度的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 外加氮源濃度對菌株NCY-2生長的影響Fig.3 Effect of additional nitrogen sources concentration on strain NCY-2 growth

由圖3可知，隨著（NH4）2SO4和尿素含量的增加，菌株NCY-2的菌體濃度呈明顯的下降趨勢，當（NH4）2SO4的質(zhì)量濃度為0.1 g/L時，菌體濃度最高為2.32×108個/mL，僅為圖2最優(yōu)結(jié)果的58%。研究結(jié)果表明，外加氮源（NH4）2SO4和尿素不能改善NCY-2的菌體生長情況，過高的氮源含量反而限制了菌體的生長。因此確定麥芽汁培養(yǎng)基自身氮源能夠滿足菌株NCY-2的生長，不需要外加氮源。

2.4 菌株NCY-2生長條件優(yōu)化結(jié)果

大量的研究結(jié)果表明[29-30]，發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH、以及菌種接種量對菌體生長有重要影響，菌株NCY-2生長條件優(yōu)化結(jié)果如表4所示。

表4 菌株NCY-2發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of U 5(54)uniform experiments for fermentation technology optimization of strain NCY-2

利用DPS軟件，采用多因子及互作項逐步回歸方法建立了菌體濃度對數(shù)值與各因素交互作用的回歸方程：Y=4.693 11+0.021 10X1X2+0.000 10X1X3-0.000 86X1X4。多因子及互作項逐步回歸分析的相關(guān)統(tǒng)計學結(jié)果如表5所示。

表5 菌體濃度對數(shù)值回歸方程的統(tǒng)計學分析Table 5 Statistical analysis of bacterial concentration on numerical regression equation

相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R2adj=0.999 5，總體顯著性檢驗值F=1369.1369，顯著水平P=0.0199＜0.05，表示該模型具有顯著的統(tǒng)計學意義；剩余標準差S=0.0094。由回歸方程得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：溫度31.2℃、pH5.5、轉(zhuǎn)速221 r/min、接種量4%，菌體濃度預(yù)測值Y=8.88。為便于實際操作，修正最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為溫度31℃、pH5.5、轉(zhuǎn)速220 r/min、接種量4%。在此優(yōu)化條件下，搖瓶培養(yǎng)后發(fā)酵液中的實際菌體濃度可達4.79×108個/mL（即Y=8.68），高于試驗組中的任何一組樣本值，并且與預(yù)測值基本吻合。進一步驗證了試驗的合理性。

2.5 甲醇添加方式對菌株NCY-2的影響

由圖4可知，不同的甲醇添加方式對菌株NCY-2的影響較大。甲醇定量添加方式中，蛋清溶菌酶酶活力隨著甲醇濃度的升高先增加后減少，定量添加3（即甲醇添加量1.5%）時，酶活力最高為488.1U/mL，是定量添加4（即甲醇添加量2%）的1.33倍。遞增添加時蛋清溶菌酶酶活力為646.6U/mL，是定量添加3（即甲醇添加量1.5%）的1.32倍。倒序添加僅為定量添加3（即甲醇添加量1.5%）的76%。研究結(jié)果顯示，遞增添加對菌株NCY-2影響最大，倒序添加抑制了菌株NCY-2的表達，蛋清溶菌酶酶活力最低。

圖4 甲醇添加方式對菌株NCY-2的影響Fig.4 Effect of methanol addition modes on strain NCY-2

2.6 菌株NCY-2表達條件優(yōu)化結(jié)果

菌株NCY-2表達條件優(yōu)化結(jié)果見表6。

表6 表達條件優(yōu)化均勻設(shè)計U5（54）試驗方案及結(jié)果Table 6 Design and results of uniform experiments for expression conditions optimization

利用DPS軟件，采用多因子及互作項逐步回歸方法建立了溶菌酶活力與各因素交互作用的回歸方程：E=858.62398+352.963 21B-733.581 82D-0.069 09AC。

多因子及互作項逐步回歸分析的相關(guān)統(tǒng)計學結(jié)果如表7所示：

表7 溶菌酶酶活力回歸方程的統(tǒng)計學分析Table 7 Statistical analysis of regression equation of lysozyme activity

相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R2adj=0.999 6，總體顯著性檢驗值F=1511.6115，顯著水平P=0.0187＜0.05，表示該模型具有顯著的統(tǒng)計學意義；剩余標準差S=8.1162。由回歸方程得到的最優(yōu)表達條件為：溫度18.3℃、pH 4.4、轉(zhuǎn)速188.1 r/min、甲醇初始添加量0.3%，蛋清溶菌酶酶活力預(yù)測值Y=981.1。為便于實際操作，修正最優(yōu)表達條件為溫度18℃、pH 4.4、轉(zhuǎn)速190r/min、甲醇初始添加量0.3%。在此優(yōu)化條件，搖瓶培養(yǎng)后發(fā)酵液中蛋清溶菌酶酶活力實際值為962.4 U/mL，即Y=962.4，高于任何一組樣本值，并且與預(yù)測值基本吻合。為實驗的可靠性提供了理論依據(jù)。

菌株NCY-2利用甲醇作為唯一誘導劑來進行誘導表達。一方面，在誘導表達期間，甲醇可以作為碳源為菌體的生長代謝提供營養(yǎng)來源；另一方面，作為啟動子在醇氧化酶的作用下，進行目的蛋白的分泌表達[31]。大量資料顯示，利用甲醇誘導型重組畢赤酵母來進行誘導表達時，發(fā)酵液中的甲醇含量＞3%時，會對菌體產(chǎn)生毒害作用[32]。本研究中，菌株NCY-2的最佳甲醇初始添加量為0.3%，之后每隔24 h分別添加體積分數(shù)1.0%、1.5%、2.0%，誘導72 h至酶活最高時結(jié)束，整個誘導過程甲醇含量始終低于3.0%，與上述資料研究結(jié)果相符合。

3 結(jié)論

本研究完善了前者試驗中存在的一些不足。與BMMY/BMGY培養(yǎng)基相比，采用價格低廉、營養(yǎng)豐富的麥芽汁作為培養(yǎng)基，不僅解決了前者營養(yǎng)單一，高溫滅菌容易產(chǎn)生沉淀等問題，而且極大地降低了發(fā)酵成本。麥芽汁培養(yǎng)基具有進一步放大培養(yǎng)的研究價值。

菌株NCY-2在生長階段的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度31℃、pH 5.5、轉(zhuǎn)速220r/min、接種量4%，菌體濃度為4.79×108個/mL，是優(yōu)化前的2.08倍；酶表達階段的最佳表達條件為溫度18℃、pH 4.4、轉(zhuǎn)速190 r/min、甲醇初始添加量0.3%（之后每隔24 h分別添加體積分數(shù)1.0%、1.5%、2.0%，誘導72 h結(jié)束），蛋清溶菌酶酶活力為962.4 U/mL。