韋云路，李 璐，李全宏*

（中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院 國家果蔬加工工程技術研究中心 農業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，北京 100083）

南瓜（Cucurbita spp.）屬葫蘆科南瓜屬，一年生草本植物[1]，其營養(yǎng)價值豐富，具有多種保健和藥用功效。南瓜果實中不僅含有多糖、果膠、纖維素等碳水化合物類，還含有蛋白質、脂肪、維生素及礦物質等多種營養(yǎng)物質，同時南瓜提取物還可作為藥材[2]。研究表明，南瓜具有抗氧化、抗腫瘤[3]、保肝護肝[4]、降血脂[5]、調節(jié)免疫[6]和改善Ⅱ型糖尿病[7]等益生作用。在我國廣泛種植栽培南瓜的大背景下，南瓜的綜合利用尚不完善，主要作為蔬菜以鮮食為主，通過深加工技術開發(fā)多種南瓜產品以提高南瓜的附加值，其市場及產業(yè)化前景更加廣闊[8-9]，因此，研究開發(fā)新型的南瓜功能性食品有利于南瓜資源的開發(fā)利用。隨著生活水平的提高，人們對食品的要求也不僅只停留在解決溫飽，而是更加注重其營養(yǎng)和保健功效。以果蔬為原料開發(fā)的果蔬醋大多數(shù)都果香、醋香濃郁，營養(yǎng)豐富、酸甜可口[10]，加以利用復合菌株在發(fā)酵過程中的相互協(xié)作，通過微生物代謝途徑產生豐富的代謝產物，產生既能夠保留原料的營養(yǎng)成分和香氣成分，又兼具有保健功能的果醋產品，具有廣闊的消費市場和開發(fā)前景[11]。VIANA RO等[12]研究以開菲爾菌種釀造蘋果醋，發(fā)現(xiàn)開菲爾蘋果醋中有機酸種類和含量豐富，且含有多種微生物，經鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）和Acetobacter syzygii。李迎楠[13]采用復合菌株發(fā)酵酸漿果醋并研究其活性成分，發(fā)現(xiàn)得到的酸漿果醋口感柔和，營養(yǎng)成分豐富，總酸含量可達51 g/L，含有多種氨基酸和有機酸，同時含有1.31 mg/mL胡蘿卜素。吳茂玉等[14]在蘋果醋釀造過程中采用增香酵母和乳酸菌進行發(fā)酵，制得的果醋飲料澄清透明，光澤度好，且具有蘋果特有的果香。

本研究開發(fā)了一種新型的復合菌株發(fā)酵南瓜醋飲料，以南瓜為原料，將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）滬釀1.01與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）復合菌株以一定的比例接種于經過復合酶處理的南瓜漿中進行發(fā)酵，酵母菌可以首先分解利用果蔬原料中的大分子營養(yǎng)物質，通過代謝碳水化合物產生乙醇；而通過醋酸菌的作用，可進一步將乙醇轉化為乙酸；加上嗜酸乳桿菌可以代謝乙酸和部分有機酸生成風味較為柔和的乳酸，積累豐富的有機酸等代謝產物[13]，從而制得既具有南瓜保健成分，又香氣濃郁、口感醇厚的南瓜醋產品[15]。果醋類產品對澄清度要求較高，因此本研究考察澄清劑種類、澄清劑復配比例以及澄清溫度和時間對南瓜醋的澄清效果的影響，并通過單因素和正交設計優(yōu)化南瓜醋的澄清工藝條件，并考察南瓜醋的抗氧化能力，以期為新型發(fā)酵南瓜醋的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料及菌株

新鮮南瓜：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）滬釀1.01、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 化學試劑

β-葡聚糖酶（10萬U/g）：山東欣鼎生物科技有限公司；糖化酶（5萬U/g）：多味化工食品有限公司；纖維素酶（2萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；果膠酶（5萬U/g）：和氏璧生物科技有限公司；明膠、殼聚糖、硅藻土和羧甲基纖維素鈉（均為食品級）：鄭州安安康食品原料有限公司；皂土（食品級）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：北京化工廠；總抗氧化能力測試盒、抑制羥自由基試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽浸粉肉湯（malt extract broth，MEB）培養(yǎng)基：麥芽浸粉 20 g/L，pH調至6.9±0.2，121℃滅菌15 min。用于酵母菌的培養(yǎng)。

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，硫酸鎂0.1 g/L，醋酸鈉5.0g/L，檸檬酸銨2.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，吐溫80 1.0 mL/L，硫酸錳0.05 g/L，pH調至6.9±0.2，121℃滅菌15 min。用于乳酸菌的培養(yǎng)。

醋桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母提取物10 g/L，121℃高壓滅菌15min，臨用前加4%過濾除菌的無水乙醇。

1.2 設備與儀器

JYZ-E91九陽料理機：九陽股份有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：天津科諾儀器設備有限公司；DHG-9203A電熱恒溫鼓風干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16A臺式高速冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司：UV-2802紫外可見光分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司；imark酶標儀：美國Bio Rad公司；HZQ-F160全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉市豪誠實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合菌株發(fā)酵南瓜醋的加工工藝流程及操作要點

南瓜漿的制備：新鮮南瓜洗凈、去皮、切塊，將南瓜塊與蒸餾水按照1∶3（g∶mL）置于料理機中打漿，得到新鮮的南瓜漿。

酶解：采用由糖化酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶和果膠酶（1∶1∶1∶1）組成的復合酶進行酶解，總酶添加量為0.4 g/L，酶解溫度50℃，酶解時間50 min，沸水浴10 min滅酶。

殺菌、冷卻：酶解南瓜漿121℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻至室溫后備用。

接種發(fā)酵：按總接種量10%，復合菌種接種比例（釀酒酵母/巴氏醋桿菌滬釀1.01/嗜酸乳桿菌1∶2∶2），先向南瓜漿中接種2%釀酒酵母菌，30℃培養(yǎng)2 d，再向其中接種4%巴氏醋桿菌滬釀1.01，30℃培養(yǎng)3 d，最后接種4%嗜酸乳桿菌，30℃培養(yǎng)2 d，結束發(fā)酵。

澄清：考察澄清劑種類、復配比例、靜置溫度和靜置時間對南瓜醋的影響，優(yōu)化澄清工藝，得到南瓜醋成品。

1.3.2 單一澄清劑的篩選

將配制的1%明膠溶液、硅藻土懸浮液、殼聚糖溶液、羧甲基纖維素鈉溶液及皂土懸浮液分別以1%、2%、3%、4%、5%加入等量的復合菌株在最佳工藝條件下發(fā)酵的南瓜醋中，25℃靜置12 h，離心（8 000 r/min、10 min）、過濾，取上清液測定透光率，每組做3次平行試驗，選取效果最佳的澄清劑及其最適的添加比例。

1.3.3 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化單因素試驗

根據(jù)單一澄清劑的篩選試驗結果，選取兩種效果較好的澄清劑進行復配，復合澄清劑添加量4%，并探究殼聚糖和明膠體積比（1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、1∶1）、靜置溫度（5 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45℃）和靜置時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h）對澄清效果的影響。

1.3.4 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，復合澄清劑添加量4%，以復配比例（A）、靜置溫度（B）和靜置時間（C）3個因素進行正交試驗。使用Minitab 16軟件，以透光率為評價指標，采用L9（34）正交試驗，確定復配澄清劑澄清南瓜醋的最佳澄清工藝條件。

1.3.5 分析檢測

澄清度的測定：取澄清后的南瓜醋，經離心和過濾后，取清液，在波長650 nm條件下，以蒸餾水為參比，測定清液的吸光度值A，計算溶液的透光率T，計算公式為T＝10-A?？偹岷康臏y定：采用酸堿滴定法；有機酸測定：乳酸、丁二酸（琥珀酸）、檸檬酸、酒石酸和富馬酸含量的測定參考國標GB 5009.157—2016《食品安全國家標準食品有機酸的測定》，乙酸和草酸的測定采用離子色譜法；抗氧化活性測定：總抗氧化能力測定采用總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定試劑盒、羥自由基清除能力采用羥自由基測定試劑盒。

2 結果與分析

2.1 單一澄清劑的篩選

圖1 不同澄清劑對南瓜醋的澄清效果Fig.1 Effect of different clarifying agents on clarification effect of pumpkin vinegar

由圖1可知，5種澄清劑中殼聚糖和明膠的澄清效果較好，在添加量相對較小的情況下，澄清樣品也具有較高的透光率。殼聚糖較優(yōu)的添加量為2%，此時南瓜醋透光率為89.3%，明膠較優(yōu)的添加量為4%，此時南瓜醋的透光率為92.1%。其余幾種澄清劑雖然澄清效果與這兩種相差不大，但是添加量間相對較大，可能會對南瓜醋的風味等產生較多不良影響，因此，選擇殼聚糖和明膠兩種澄清劑復配進一步探究南瓜醋澄清工藝。

2.2 復配比例對澄清效果的影響

由圖2可知，隨著殼聚糖和明膠體積比的變化，透光率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，殼聚糖和明膠體積比為1∶5～2∶5時，透光率呈現(xiàn)上升趨勢；在殼聚糖和明膠體積比為2∶5時，澄清效果最佳，透光率達到97.1%；殼聚糖和明膠體積比為2∶5～1∶1時，透光率呈現(xiàn)下降趨勢?？赡苡捎跉ぞ厶呛兔髂z體積比為2∶5左右時，澄清劑引起的絮凝效果最佳，復配帶來的“架橋”作用達到最佳的效果[16]。因此，殼聚糖和明膠最佳體積比為2∶5。

圖2 殼聚糖和明膠體積比對澄清效果的影響Fig.2 Effect of volume ratio of chitosan to gelatin on clarification effect

2.3 靜置溫度對澄清效果的影響

圖3 靜置溫度對澄清效果的影響Fig.3 Effect of standing temperature on clarification effect

由圖3可知，隨著靜置溫度在5～45℃范圍內升高，透光率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，靜置溫度在5～25℃范圍內升高，透光率呈現(xiàn)先上升趨勢；靜置溫度為25℃時為最佳，透光率可達95.3%；靜置溫度高于25℃之后，透光率呈現(xiàn)下降趨勢。因此，最佳靜置溫度為25℃。

2.4 靜置時間對澄清效果的影響

圖4 靜置時間對澄清效果的影響Fig.4 Effect of standing time on clarification effect

由圖4可知，透光率隨著靜置時間的延長呈現(xiàn)先略微上升后下降趨于穩(wěn)定的趨勢，靜置時間在2～4 h時，透光率隨著靜置時間的延長而增大；靜置時間為4 h時，透光率達到最高，為94.5%左右；靜置時間＞4 h之后，透光率隨著靜置時間而下降。因此，選擇最佳靜置時間為4 h。

2.5 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化正交試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，選擇殼聚糖和明膠體積比、靜置溫度和靜置時間3個因素，進行正交試驗。正交試驗的結果與分析見表1。

表1 南瓜醋澄清工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for clarification technology optimization of pumpkin vinegar

由表1可知，根據(jù)R值大小，得出因素影響的主次順序RB＞RC＞RA，靜置溫度＞靜置時間＞殼聚糖和明膠體積比。正交試驗的最優(yōu)組合為A1B2C2，即殼聚糖和明膠比例1∶5，靜置溫度25℃，靜置時間4 h。在此優(yōu)化澄清工藝條件下，其透光率可達（93.1±1.2）%。

2.6 產品品質指標測定分析

2.6.1 南瓜醋與南瓜漿中總酸和有機酸組成

表2 南瓜醋與南瓜漿中有機酸種類及含量Table 2 Types and contents of organic acids in pumpkin vinegar and pumpkin pulp g/L

由表2可知，南瓜醋總酸含量為52.1 g/L，達到農業(yè)部行業(yè)標準NYT 2987—2016《綠色食品果醋飲料》中規(guī)定的總酸含量標準（≥3 g/kg）。與酶解南瓜漿相比，南瓜醋中有機酸的種類和含量整體都有不同程度的改變，這可能是由于發(fā)酵過程中，原料中的部分有機酸被釀酒酵母、醋桿菌和嗜酸乳桿菌等微生物利用生成新的有機酸[17]。如酒石酸在乳酸菌作用下可能降解為乳酸和乙酸，釀酒酵母作用于果蔬汁會生成一些檸檬酸，但檸檬酸又容易在乳酸菌的作用下被大量消耗生成醋酸[18]。琥珀酸絕大部分源于酒精發(fā)酵過程中糖類物質發(fā)酵后的產物。

有機酸的含量及其各自獨特的味道是構成果醋獨特酸味味感的主要因素[19]。琥珀酸鮮味比較突出，蘋果酸清爽稍帶濕味，這些有機酸的味道可以調節(jié)乙酸強烈的刺激，從而使果醋的酸味更加平和、醇厚。復合菌株發(fā)酵得到的南瓜果醋有機酸種類豐富，其中乙酸和乳酸含量最高，草酸也可作為主體有機酸的一部分，另外還含有檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等。醋的酸味質量、緩沖性及酸度與有機酸的種類、含量組成和相互比例有直接關系，乙酸口感上刺激性較大，乳酸相對口感醇厚柔和；琥珀酸鮮味比較突出，但了略帶香味可以緩沖乙酸的刺激性。有機酸含量取決于發(fā)酵原料的糖和稀釋乙醇的濃度，與其特有的味道構成果醋獨特的味感。

2.6.2 南瓜醋的抗氧化能力

圖5 不同種類醋樣品的總抗氧化能力（A）及抑制羥自由基能力（B）Fig.5 Total antioxidant capability(A)and hydroxyl radicals scavenging capability(B)of different kinds of vinegar samples

食醋產品都具有一定的抗氧化能力，將南瓜醋與市售的米醋、蘋果醋的總抗氧化能力和抑制羥自由基的能力進行了比較。由圖5可知，南瓜醋的總抗氧化能力（1.3 U/mL）和羥基自由基清除能力（71%）低于蘋果醋，但高于市售的米醋?？赡苁怯捎诎l(fā)酵底物不同，發(fā)酵液中的抗氧化物的種類和含量不同，導致了各種食醋的抗氧化能力有一定的差異。孫璐宏等[20]研究柿果醋生產過程中抗氧化性能變化，發(fā)現(xiàn)柿果醋對DPPH自由基的清除能力在陳釀結束時可達到51.89%；王志煌[21]以椰棗為原料制作果醋，當濃度為8%時，椰棗果醋對DPPH自由基的清除達到97%；此外，市售的食醋大多經過嚴格的澄清殺菌等工藝，也會造成一些抗氧化物質的損失。

3 結論

本研究以復合菌株發(fā)酵南瓜醋，選擇釀酒酵母、巴氏醋桿菌滬釀1.01和嗜酸乳桿菌3種菌株，以殼聚糖和明膠復配比例、靜置溫度和靜置時間為探究因素進行單因素試驗，采用正交試驗設計優(yōu)化澄清工藝參數(shù)。結果表明，最佳澄清工藝條件為殼聚糖和明膠體積比1∶5，靜置溫度25℃，靜置時間4 h。在此優(yōu)化條件下，南瓜醋透光率為（93.1±1.2）%。制得的南瓜醋產品總酸含量52.1 g/L，包含豐富的有機酸種類，其中乙酸和乳酸含量最高，分別為3.0 g/L和0.49 g/L，總抗氧化能力和羥基自由基清除率分別可達1.3 U/mL、71%，表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化活性，且表現(xiàn)出了良好的體外抗氧化活性。