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1997年發(fā)現(xiàn)四川省第一塊鼠疫自然疫源地暨石渠縣青海田鼠鼠疫疫源地，到2007年發(fā)現(xiàn)德格縣喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，2011年發(fā)現(xiàn)巴塘縣喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，2012年發(fā)現(xiàn)理塘縣喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，2014年發(fā)現(xiàn)雅江縣喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，2015年發(fā)現(xiàn)新龍縣喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地，至今四川已有2類6塊鼠疫自然疫源地[1-7],共分離百余株鼠疫菌，主要分為青藏高原青海田鼠型鼠疫菌和青藏高原喜馬拉雅旱獺型鼠疫菌。

規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)是一個在細(xì)菌中的DNA序列家庭，序列包含能攻擊細(xì)菌的病毒DNA片段，在細(xì)菌遭到病毒攻擊時，使用這些片段可以檢測和破壞來自相似的病毒DNA，這也是細(xì)菌對病毒的防御及免疫策略。這些序列在細(xì)菌的防御系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,這就是被人熟知的CRISPR/Cas9的技術(shù)基礎(chǔ)。在鼠疫耶爾森菌中，有3個CRISPR位點，并且位于鼠疫菌基因的不同位置，同向重復(fù)大多數(shù)都很保守，而且序列具有很高的多態(tài)性，可以作為細(xì)菌分型及進化的一個技術(shù)[8-9]。近年來我國也展開了鼠疫菌CRISPR基因分型、進化方面的研究工作，比如徐小青等將青海省102株鼠疫菌進行CRISPR分型，共發(fā)現(xiàn)24個CRISPR基因型9大類群[10]，楊光璨將云南省171株鼠疫菌分為3個基因簇和4個基因型[11]，葛亞俊將甘肅193株鼠疫菌分為2個基因簇個4個基因型[12]，新疆也開展了鼠疫CRISPR分型研究[13]，特別是Cui等人將我國12類鼠疫自然疫源地的菌株分為9個CRISPR基因簇群，共37種基因型，對我國鼠疫菌CRISPR的分型研究工作具有重要的意義[14]。四川省鼠疫疫源地不僅發(fā)現(xiàn)較晚，而且在基因分型相關(guān)方面的研究起步也晚，為了分析四川鼠疫菌基因分型和地理分布，開展了鼠疫菌CRISPR基因分型研究工作?，F(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗菌株 選擇來源于1997—2016年四川鼠疫疫源地具有代表性的132株鼠疫菌，其中石渠縣58株，德格縣25株，巴塘縣6株，理塘縣8株，雅江縣34株，新龍縣1株，菌株涵蓋了四川所有的鼠疫疫源縣。

1.2鼠疫菌培養(yǎng)及核酸提取 將鼠疫菌接種于赫氏平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，按照Wizard Genomic DNA Purifcation Kit操作規(guī)程在中國疾病預(yù)防控制中心P3實驗室中提取鼠疫菌核酸。

1.3 試劑及儀器耗材

1.3.1試劑 超純水；含有buffer、dNTP 、Taq DNA聚合酶的PCR擴增混合液(Taq Mix(2xEasy Taq○RTM PCR SuperMix +dye，全式金生物技術(shù)有限公司)；TBE電泳緩沖液；瓊脂糖；核酸染料；DNA Marker (100bp Plus DNA Ladder Marker, 全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.3.2儀器和耗材 PCR擴增儀、水平電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀。10 μL,100 μL,200 μL,1000 μL的移液器及其槍頭，0.2 mL PCR反應(yīng)管，1.5 mL EP管，以及離心機(可調(diào)14K轉(zhuǎn))。

1.4引物和PCR擴增方法 使用YPa-L：(5′-AATTTTGCTCCCCAAATAGCAT-3′)，YPa-R：(5′-TTTTCCCCATTAGCGAAATAAGT A-3′)；YPb-L：(5′-ATATCCTGCTTACCGAGGGT-3′),YPb-R：(5′-AATCAGCCACGCTCTGTCTA-3′)和YPc-L：(5′-GCCAAGGGATTAGTGAGTTAA-3′)，YPc-R：(5′-TTTA CGCATTTTGCGCCATTG-3′)3對擴增引物，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，按照引物檢測報告說明使用。PCR反應(yīng)體系25 μL：超純水7.5 μL，2×PCR Supermix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL。PCR擴增條件：預(yù)變性:95 ℃，5 min；變性：95 ℃，40 s,退火：55 ℃，40 s，延伸：72 ℃，40 s，共30個循環(huán)；再延伸：72 ℃，5 min。

1.5測序 電泳確定PCR擴增成功后，對PCR產(chǎn)物送測序技術(shù)服務(wù)公司(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司)進行雙向測序，獲得拼接后的序列資料，通過CRISPR網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/)中的“CRISPRs Finder”工具得到CRISPR Cluster與Genotyper 的相關(guān)信息。根據(jù)Cui等人[4]提出的命名方法和序列資料將間區(qū)序列命名和分型。最后，結(jié)果整理成Excel形式保存。

1.6分析方法 Excel 2007和MapInfo軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1四川省鼠疫菌地理分布 依據(jù)1997—2016年四川省鼠疫疫源地調(diào)查結(jié)果，青海田鼠型的鼠疫菌株分布在石渠縣俄多瑪鄉(xiāng)紅旗橋地區(qū)，而石渠縣1997年人間鼠疫發(fā)生時分離的鼠疫菌來源于石渠縣呷儀鄉(xiāng)(流行病學(xué)證實由青海省輸入)，德格縣的鼠疫菌菌株分布在雀兒山以西的柯洛洞鄉(xiāng)、更慶鎮(zhèn)鄉(xiāng)和八邦鄉(xiāng)，巴塘縣(亞日貢鄉(xiāng)、德達鄉(xiāng)和茶洛鄉(xiāng))、理塘縣(禾尼鄉(xiāng))、雅江縣(紅龍鄉(xiāng)和柯拉鄉(xiāng))和新龍縣(友誼鄉(xiāng))菌株分布在以格聶山為中心的周圍地帶。所有菌株都分布在金沙江(左)和雅礱江(右)之間的山脈，暨沙魯里山脈—金沙江和雅礱江的分水嶺，見圖1。

2.2四川省鼠疫菌CRISPR分型結(jié)果 四川省132株鼠疫菌共發(fā)現(xiàn)17種spacer，包括YPa 9種、YPb 5種、YPc 3種，新發(fā)現(xiàn)的1種space陣列。所有鼠疫菌株被分為2個CRISPR基因簇(Cc3′,Ca7)，3個基因型(37′型、22型和sc01型)。其中石渠縣57株青海田鼠型鼠疫菌基因型為37′型,石渠縣1999年人間鼠疫的菌株為22型，德格縣25株旱獺型鼠疫菌基因型為22型，巴塘縣、理塘縣、雅江縣和新龍縣共49株旱獺型鼠疫菌基因型為sc01型。見表1。

圖1 四川省鼠疫菌地理分布圖Fig.1 Geographical distribution of Y. pestis strain in Sichuan province

表1 四川鼠疫菌CRISPR分型結(jié)果
Tab.1 CRISPR-genotype results of Y. pestis strains in Sichuan province

地點數(shù)量宿主序列YPaYPbYPcCRISPR基因簇基因型石渠縣57青海田鼠a1-a4-a6'b1-b2-b3-b4-b10c1-c2-c3Cc3'37'石渠縣1人a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca722德格縣25喜馬拉雅旱獺a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca722巴塘縣6喜馬拉雅旱獺a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01理塘縣8喜馬拉雅旱獺a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01雅江縣34喜馬拉雅旱獺a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01新龍縣1喜馬拉雅旱獺a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-sc1b1-b2-b3-b4c1-c2-c3Ca7sc01

注：sc01為新發(fā)現(xiàn)的 Spacer，序列為5′-GTTTTCACCACCGCCGTGACATTCTTCCGGC-3′,位于CO92，CP009973.1：548129-548159.

2.3四川省鼠疫菌CRISPR基因分型分布 四川省鼠疫菌CRISPR基因型具有明顯的地理分布特征，基因37′型分布在四川省甘孜州石渠縣俄多瑪鄉(xiāng)(省道217附近)，基因22型分布在四川省甘孜州德格縣(國道317附近)，基因sc01型分布在四川省甘孜州巴塘縣、理塘縣、新龍縣和雅江縣(國道318附近)，由于石渠縣人間鼠疫由青海省傳入，該菌株未列入四川省鼠疫菌CRISPR基因分型分布圖。見圖2。

圖2 四川省鼠疫菌CRISPR基因分型分布圖Fig.2 CRISPR-genotype geographical distribution of Y. pestis strain in Sichuan province

3 討 論

四川省鼠疫疫源地位于四川省甘孜藏族自治州，西與西藏相鄰，北與青海省相鄰，是青藏高原的一部分，地形地貌氣候復(fù)雜。從四川鼠疫菌菌株地理分布看，我省所有鼠疫菌都分布在金沙江和雅礱江之間，暨沿著沙魯里山脈(莫拉山—子拉山—雀兒山—治南山—素龍山—扎噶山)一線分布，菌株的分布具有明顯的地理分布特征。本研究利用鼠疫菌CRISPR分型方法，將四川省132株鼠疫菌株分成2個CRISPR基因簇(Cc3′,Ca7)和3個基因型(37′型、22型和sc01型)，并且發(fā)現(xiàn)一個新的Spacer，將該基因型命名為sc01型。37′型分布在石渠縣，22型分布在德格縣，sc01型分布在巴塘縣、理塘縣、雅江縣和新龍縣，可見四川省鼠疫菌CRISPR分型具有明顯的地理分布特征。石渠縣Cc3′(37′)型與徐小青等[10]研究的青海省稱多縣青海田鼠鼠疫自然疫源地G6a型相同，且與Cui[14]研究發(fā)現(xiàn)的石渠縣鼠疫菌Cc3在a6有區(qū)別(在3′端少CA兩個堿基),和內(nèi)蒙錫林郭勒布氏田鼠鼠疫自然疫源地Cc1(36型)相比在YPb少了b10和YPc少了c2和c3。石渠人間鼠疫的菌株為Ca7(22型)，已經(jīng)從流行病學(xué)調(diào)查中證實此菌株由青海省輸入(圖1青綠色箭頭)。該菌株的型別與德格縣的菌株Ca7(22型)相同，并且青海省的玉樹、囊謙、曲麻萊和稱多等地的菌株為Ca7型[10],而西藏的菌株主要為Cb4型[14]，云南的菌株為Ca52(劍川)、Ca8及Ca7型(玉龍)[11]。但是云南麗江玉龍位于四川甘孜州下部，靠近四川涼山州鹽源縣和攀枝花的格薩拉地區(qū)，可以確定四川省德格縣的鼠疫菌菌株應(yīng)該由青海省玉樹市傳入，鼠疫菌繼續(xù)沿著德格縣境內(nèi)的雀兒山山脈繼續(xù)向南傳播，在遇到不同的生態(tài)環(huán)境，為了適應(yīng)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)壓力，其基因也發(fā)生了改變，逐步進化出sc01型(圖1紅色箭頭)。另外從四川的鼠疫疫源地近30多年的調(diào)查來看，在雅礱江的右岸地區(qū)，如甘孜縣、色達縣、爐霍縣和道孚縣等地并未發(fā)現(xiàn)陽性犬血清和分離出鼠疫菌株，并且在四川攀枝花市發(fā)現(xiàn)陽性血清的西區(qū)和福田地區(qū)也位于金沙江和雅礱江之間。從以上分析可以推斷出四川省甘孜州鼠疫疫源地只分布在金沙江和雅礱江之間，這對甘孜州、涼山州和攀枝花今后鼠疫疫源地調(diào)查有著一定的指導(dǎo)依據(jù)。