李志 劉麗萍 房真 郗冬梅

摘 要 納米孔分析技術(shù)是一種低成本、無(wú)需熒光標(biāo)記和擴(kuò)增的單分子檢測(cè)技術(shù)，其中基于固體材料的納米孔由于穩(wěn)定性高、耐受性好、尺寸可控、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。固體納米孔主要由薄膜和管材料兩種類型材料制備，其中常見(jiàn)的薄膜納米孔包括氮化硅、二維材料、氧化鋁以及聚合物薄膜，管材料主要包括玻璃毛細(xì)管和碳納米管。本文總結(jié)了固體納米孔分析技術(shù)的研究進(jìn)展，展望了發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞 固體納米孔； 單分子分析； DNA測(cè)序； 評(píng)述

1 引 言

納米孔分析技術(shù)是從20世紀(jì)90年代中期開始發(fā)展起來(lái)的單分子分析手段。1996年，研究人員首次利用α-溶血素天然生物通道蛋白獲得寡核苷酸的阻斷電流信號(hào)[1]，開啟了納米孔研究的熱潮。該技術(shù)憑借其快速、低成本、無(wú)需熒光標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，在化學(xué)和生物等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前納米孔分析技術(shù)不僅用于DNA測(cè)序，在單分子傳感分析領(lǐng)域也取得了令人矚目的成績(jī)。根據(jù)分子穿過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的特征性阻斷電流信號(hào)，可實(shí)時(shí)獲取待測(cè)物的結(jié)構(gòu)、組成、尺寸、電荷、構(gòu)象以及與其它分子相互作用的動(dòng)力學(xué)信息。多種生物膜蛋白，包括氣單胞菌溶素（Aerolysin）[2，3]、恥垢分支桿菌（MspA）[4]、大腸桿菌細(xì)胞溶素A（ClyA）[5]、鐵異羥肟酸提取組分 A（FhuA）[6]、噬菌體phi29 DNA-裝配馬達(dá)[7]和超穩(wěn)定蛋白1（SP1）[8]等都已被用于構(gòu)建生物納米孔道，極大地拓寬了生物納米孔傳感技術(shù)的應(yīng)用范圍，已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了綜述介紹[9-11]。

隨著微加工技術(shù)的迅速發(fā)展，研究人員分別以氮化硅[12，13]、石墨烯[14，15]、氧化鋁[16]、聚合物薄膜[17]、玻璃毛細(xì)管[18]、碳納米管[19]等為材料，成功制造了固體納米孔。由于材料不同，制備固體納米孔的方法也不同，常用的主要有離子束雕刻[20]、電子束鉆孔法[21]、原子層沉積法[22]和徑跡刻蝕法[23]等，對(duì)此Dekker[24]、Matile[25]和Li[26]等都做過(guò)較為全面的文獻(xiàn)綜述。本文主要總結(jié)了近年來(lái)常用的固體納米孔的種類及在DNA測(cè)序和生物傳感中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

2 固體納米孔的種類及應(yīng)用研究進(jìn)展

固體納米孔因其穩(wěn)定性高、耐受性好、尺寸可控、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于DNA測(cè)序研究以及核酸、蛋白質(zhì)、小分子等的單分子檢測(cè)。目前，固體孔主要由薄膜和管型兩種不同類型的材料制備而成。

2.1 薄膜納米孔

薄膜材料由于具有特殊的界面結(jié)構(gòu)，成為制備固體納米孔的優(yōu)良材質(zhì)，常用的薄膜材料包括氮化硅、二維材料、氧化鋁以及聚合物薄膜等。

2.1.1 氮化硅 2001年，Golovchenko課題組首次使用離子束在氮化硅（Si3N4）薄膜上制備出固體納米孔[20]，并應(yīng)用于DNA分子檢測(cè)，打開了固體納米孔檢測(cè)技術(shù)的大門。他們首先在自支撐的氮化硅薄膜反面通過(guò)反應(yīng)離子刻蝕制造一個(gè)碗型的凹槽，再使用帶反饋控制的Ar+離子束從正面減薄凹槽區(qū)域，直到薄膜擊穿形成納米孔，孔徑約為60 nm，進(jìn)一步利用氬離子束輻射能夠?qū)⒖讖绞湛s至1.8 nm。

氮化硅納米孔因具有結(jié)構(gòu)致密、疏水性、化學(xué)穩(wěn)定性好、介電常數(shù)大等優(yōu)良特性，已被廣泛用于DNA[27]和microRNA識(shí)別[28，29]、修飾堿基區(qū)分[30]、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物過(guò)孔動(dòng)力學(xué)研究[31]、蛋白質(zhì)過(guò)孔行為分析[32]以及核小體亞結(jié)構(gòu)檢測(cè)研究[33]。2010年，Wanunu等[21]使用電子束曝光和SF6等離子干法刻蝕的方法制造出厚度僅為6 nm左右的SiN薄膜，其上包含一個(gè)直徑為3 nm的納米孔，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA的特異性識(shí)別。隨后該課題組進(jìn)一步制造出厚度5～8 nm的SiNx薄膜，納米孔的直徑介于0.8～2.0 nm之間，實(shí)現(xiàn)了poly（dA）30、poly（dC）30和poly（dT）30的有效區(qū)分[34]。最近，Long課題組可控制備了直徑< 2 nm 的SiNx納米孔道，并獲得了單個(gè)DNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的納米孔道特征解鏈信號(hào)[35]，證明所制備的SiNx 納米孔檢測(cè)靈敏度與α-溶血素生物納米孔相當(dāng)。 Plesa等[13]利用SiN納米孔道實(shí)現(xiàn)了單鏈DNA和打結(jié)的單鏈DNA、環(huán)狀DNA和打結(jié)的環(huán)狀DNA的高靈敏分辨，根據(jù)DNA穿越納米孔時(shí)的特征電流信號(hào)，能夠識(shí)別任意長(zhǎng)度的線性或環(huán)狀DNA內(nèi)部的節(jié)點(diǎn)（圖1），為研究長(zhǎng)鏈DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)開拓了新思路。

2.1.2 二維材料 二維材料得益于其原子級(jí)厚度的優(yōu)勢(shì)，成為制造納米孔的理想材料。典型的二維材料主要包括石墨烯、氮化硼、二硫化鉬等。石墨烯薄膜是一種具有獨(dú)特電子和機(jī)械性能的單層碳原子層[36，37]，厚度與DNA分子鏈中相鄰堿基之間的距離（約0.34 nm）相當(dāng)，因此成為納米孔測(cè)序技術(shù)中的首選材料。2010年，Golovchenko[38]、Dekker[39]和Drndic[40] 3個(gè)課題組開始了利用石墨烯納米孔檢測(cè)雙鏈DNA的工作，發(fā)現(xiàn)通過(guò)石墨烯納米孔的離子電流基底噪聲較大，使用原子層沉積技術(shù)在石墨烯納米孔表面沉積氧化鈦能夠有效提高石墨烯納米孔檢測(cè)的信噪比。進(jìn)一步， Schneider等[41]通過(guò)在石墨烯表面自組裝親水物質(zhì)從而阻止石墨烯對(duì)單鏈DNA的吸附，實(shí)現(xiàn)了單鏈DNA的檢測(cè)。但是，目前納米孔用于DNA測(cè)序存在巨大的挑戰(zhàn)，一方面DNA分子在納米孔內(nèi)的遷移速度太快，高達(dá)0.01～1.00 μs/堿基[15]； 另一方面，石墨烯納米孔表現(xiàn)出很高的1/f噪音[42]，無(wú)法實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的精確分辨。

為了解決上述問(wèn)題，很多研究者尋找納米孔測(cè)序的新途徑。最近，Dekker課題組制備了短而窄的石墨烯納米帶（30 nm × 30 nm），其上包含一個(gè)5 nm的納米孔，通過(guò)分析石墨烯納米孔的平面電流信號(hào)（非傳統(tǒng)的離子電流信號(hào)），研究了DNA分子穿過(guò)納米孔的行為（圖2）[43]，這種方法能夠獲得較大范圍的電流信號(hào)，促進(jìn)高帶寬檢測(cè)，從而克服傳統(tǒng)方法由于帶寬過(guò)低而難以捕捉到快速過(guò)孔的電流信號(hào)的問(wèn)題。此外，氮化硼和二硫化鉬等新興二維材料相繼被開發(fā)。Liu等[44]首先在氮化硼薄膜上使用聚焦電子束制備出直徑5 nm的納米孔），用于雙鏈DNA分子的檢測(cè)，靈敏度比SiN納米孔更高，空間分辨率與石墨烯納米孔相當(dāng)。Liu等在二硫化鉬薄膜上制造出直徑5 nm的納米孔，分析了具有豐富二級(jí)結(jié)構(gòu)的λ-DNA分子的過(guò)孔行為，表現(xiàn)出比傳統(tǒng)SiNx 更高的靈敏度[45]。Feng等[46]進(jìn)一步在單層二硫化鉬上制備出直徑2.8 nm的納米孔，通過(guò)控制液體的粘度梯度降低DNA穿越納米孔的速度，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)poly（dA）30、poly（dC）30、poly（dG）30和poIy（dT）30 4種不同核苷酸的分辨。這些二維材料在生物分子識(shí)別方面表現(xiàn)出相當(dāng)高的檢測(cè)精度，但如用于DNA測(cè)序，仍需進(jìn)一步研究探索。

2.1.3 氧化鋁 多孔氧化鋁是一類應(yīng)用廣泛的無(wú)機(jī)陣列納米通道，一般通過(guò)陽(yáng)極氧化法制備，即將鋁片置于酸性電解液中，控制一定的電壓、電流條件使其電解形成陽(yáng)極氧化鋁薄膜。通過(guò)調(diào)節(jié)電解液的種類及濃度、溫度、氧化時(shí)間及氧化電壓， 可調(diào)節(jié)多孔氧化鋁通道的孔徑。它不僅能夠作為模板合成多種納米孔道陣列，也可通過(guò)修飾功能分子模擬生物體系，用于生物小分子、有機(jī)大分子、DNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)研究[16，47，48]。Gao等[49]以陽(yáng)極氧化鋁（AAO）為模板，在限域納米孔道內(nèi)修飾了分散的金納米顆粒，產(chǎn)生“雙面神”結(jié)構(gòu)環(huán)，利用該結(jié)構(gòu)環(huán)可識(shí)別鏈狀DNA分子的單堿基錯(cuò)配。最近，Xia的課題組利用陽(yáng)極氧化鋁納米孔，通過(guò)可控的電子束蒸發(fā)技術(shù)噴鍍金和鈦，形成不同金屬修飾界面，用于區(qū)域化（孔道表面、孔道內(nèi)壁、孔道表面&孔道內(nèi)壁）組裝DNA功能分子，構(gòu)建了一類ATP分子響應(yīng)性納米孔道，通過(guò)測(cè)量跨膜離子電流和電解電流信號(hào)，系統(tǒng)研究了不同區(qū)域功能分子對(duì)離子門控的貢獻(xiàn)程度（圖3）[50]，為利用納米孔道開展跨膜離子傳輸、限閾空間電化學(xué)、生物邏輯門以及納米生物傳感器件研究提供了新思路。

2.1.4 聚合物薄膜 聚合物納米孔具有良好的生物兼容性，而且孔內(nèi)表面的活性有機(jī)基團(tuán)能夠作為多種分子的結(jié)合位點(diǎn)，極大地促進(jìn)了對(duì)納米孔道功能化修飾的研究。常用的聚合物材料有聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯（PC）和聚酰亞胺（PI）。徑跡刻蝕技術(shù)適于多種聚合物材質(zhì)，首先利用高能重離子輻照穿透聚合物膜產(chǎn)生潛在徑跡，繼而采用化學(xué)刻蝕該區(qū)域得到納米孔，納米孔的幾何形貌受刻蝕條件的控制，通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件，可得到圓柱形、錐形和雙錐形等不同形狀的納米孔[51]。

Jiang的研究組通過(guò)調(diào)整離子轟擊強(qiáng)度、腐蝕液與阻蝕液的比例以及引導(dǎo)電流和刻蝕時(shí)間、刻蝕溫度等條件，在PET和PI等高分子材料薄膜上制備出了多種不同形貌的納米孔道[52]，并進(jìn)行功能化修飾，建立了K+＼[53]、Zn2+[54]、Hg2+[55]等不同金屬離子驅(qū)動(dòng)的仿生人工納米通道平臺(tái)。Ali課題組將鐵-三聯(lián)吡啶配合物共價(jià)修飾到PET納米孔道的內(nèi)表面，基于乳清蛋白和金屬離子之間的特異性作用，實(shí)現(xiàn)了乳鐵蛋白的高靈敏、高特異性檢測(cè)（圖4）[56]，建立了一種基于金屬離子親和性的生物分子識(shí)別新方法。Liu等[57]制備了DNA超級(jí)三明治結(jié)構(gòu)，并將其修飾在PET納米孔道內(nèi)部，構(gòu)筑了可以同時(shí)檢測(cè)目標(biāo)核酸和小分子的雙檢測(cè)平臺(tái)，DNA分子的檢測(cè)限達(dá)10 fmol/L，小分子（ATP）的檢出限達(dá)1 nmol/L（圖5），能夠滿足復(fù)雜生物樣本的檢測(cè)需求。

2.2 管材料納米孔 近年來(lái)，利用管材料制備納米孔的研究發(fā)展迅速，其中玻璃毛細(xì)管憑借其化學(xué)穩(wěn)定性高、加工成本低、表面容易改性等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者的青睞。此外，文獻(xiàn)也報(bào)道了一些基于碳納米管的納米孔的研究。

2.2.1 玻璃毛細(xì)管 使用激光加熱拉伸技術(shù)，可以利用玻璃毛細(xì)管加工出直徑介于幾納米到幾百納米的納米通道，通過(guò)改變加熱溫度、時(shí)間、拉力等參數(shù)能夠調(diào)控其直徑。2010年，Steinbock等[58]制備出45 nm的玻璃毛細(xì)管并首次用于檢測(cè)雙鏈DNA的折疊狀態(tài)。Chen等[59]在長(zhǎng)鏈DNA內(nèi)部的特定位置修飾鏈霉親和素，DNA分子穿過(guò)玻璃納米孔時(shí)產(chǎn)生特征性的電流信號(hào)，以此確定DNA內(nèi)部的特定序列元件的位置。Tiwari 等[60]在玻璃納米孔內(nèi)壁修飾帶負(fù)電的神經(jīng)球蛋白（hNgb）， hNgb與帶正電的細(xì)胞色素c反應(yīng)引起電流改變，從而研究蛋白質(zhì)間的相互作用。Sze等[61]制備了直徑約16 nm的玻璃納米孔，基于λ-DNA的特殊結(jié)構(gòu)引入適配體形成DNA載體探針，同時(shí)檢測(cè)人血清中3種蛋白質(zhì)。

最近，Long課題組突破納米孔道的傳統(tǒng)概念，利用錐形玻璃納米孔進(jìn)行了一系列開創(chuàng)性研究。將“界面動(dòng)態(tài)電荷傳遞過(guò)程”限域在單獨(dú)一個(gè)納米孔道內(nèi)，構(gòu)建了單個(gè)“雙極電活性納米孔道界面”[62]。以納米孔道尖端限域空間為模板，將“電化學(xué)過(guò)程”限域在單個(gè)納米孔道內(nèi)，通過(guò)“化學(xué)-電化學(xué)”制備的策略，構(gòu)建了含有電活性尖端的無(wú)線限域納孔電極（圖6）[63]，單個(gè)無(wú)線限域納孔電極具有孔尖電荷極化增強(qiáng)效應(yīng)，顯著提升了分析物與納米電極間的動(dòng)態(tài)相互作用能力。進(jìn)一步將電活性基團(tuán)引入納米孔電極的尖端，有效調(diào)控電極界面極化電場(chǎng)，建立了納米孔電極孔尖離子流增強(qiáng)機(jī)制，將細(xì)胞內(nèi)重要氧化還原分子的微弱法拉第電流轉(zhuǎn)化為納米孔道孔尖電荷密度的實(shí)時(shí)變化過(guò)程，獲得了極易分辨的離子流增強(qiáng)時(shí)序信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)電子傳遞載體還原型輔酶Ⅰ（NADH）的高選擇性、高靈敏度測(cè)量（圖7）[64]，為在單細(xì)胞水平揭示單個(gè)氧化還原代謝分子及信號(hào)分子作用機(jī)制提供了新的測(cè)量方法。

2.2.2 碳納米管 碳納米管是管狀的納米級(jí)石墨晶體，由單層或多層石墨片圍繞中心軸按一定的螺旋角卷曲而成。基于碳納米管的天然管道結(jié)構(gòu)，Wu課題組[19，65]將直徑1～2 nm、長(zhǎng)度5～10 nm的超短單壁碳納米管穩(wěn)定地插入到磷脂雙層膜中，構(gòu)建了一種基于超短碳納米管的新型納米孔傳感器（圖8），該傳感器具備碳納米管的獨(dú)特的物理性質(zhì)，如亞原子級(jí)的平滑內(nèi)表面、大π共軛體系和超疏水的內(nèi)部環(huán)境等。研究人員進(jìn)一步在DNA鏈上羥甲基化胞嘧啶位點(diǎn)修飾了一個(gè)剛性分子，利用超短碳納米管納米孔傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)隨機(jī)序列的DNA中羥甲基化胞嘧啶位點(diǎn)的特異性識(shí)別。這種新型納米孔平臺(tái)集成了碳納米管的多種獨(dú)特性質(zhì)，可用于單分子檢測(cè)、DNA 損傷檢測(cè)、納米孔DNA 測(cè)序等領(lǐng)域。

3 展 望

固體納米孔分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于DNA測(cè)序和生物傳感分析，應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬。然而， 目前納米孔技術(shù)仍然主要用于體外檢測(cè)，將其用于細(xì)胞內(nèi)分析的研究剛剛開始。 隨著孔道材料的迅速發(fā)展以及相關(guān)儀器的不斷改進(jìn)，固體納米孔將在細(xì)胞分析甚至活體檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用，不僅能夠推動(dòng)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，還可望用于重大疾病診斷及個(gè)性化醫(yī)療等領(lǐng)域。

此外，將納米孔電化學(xué)技術(shù)與非電流的傳感技術(shù)如光譜法相結(jié)合，可同時(shí)獲得電化學(xué)和光譜信號(hào)，納米孔能夠?qū)崟r(shí)提供分析物的結(jié)構(gòu)信息，光學(xué)信號(hào)可以揭示待測(cè)物的化學(xué)性質(zhì)，為納米孔檢測(cè)提供強(qiáng)有力的信息支持。目前已有研究者開展了固體納米孔結(jié)合暗場(chǎng)顯微成像的研究工作，相信在未來(lái)的研究中，更多的光譜技術(shù)會(huì)進(jìn)入該領(lǐng)域，以構(gòu)建更加完整的單分子光電檢測(cè)平臺(tái)，獲得多重單分子行為信息，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、原位分析研究。

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Abstract Nanopore technique is a low-cost tool for single-molecule level analysis without the need of label or amplification. The solid nanopores have been widely used in many fields such as chemistry and life sciences due to their advantages such as high stability， good tolerability， controllable size， and easy for modification. The solid nanopores commonly used in recent years are fabricated using two types of materials： membrane and tube. The membrane materials include silicon nitride， two-dimensional materials， aluminium oxide， and polymer membranes. The tube materials mainly include glass capillary and carbon nanotube. This review summarizes and prospects the research progress of different solid nanopores.

Keywords Solid nanopore； Single-molecule analysis； DNA sequencing； Review

（Received 31 March 2018； accepted 14 May 2018）