張 躍 翟 珂 李 蕊 王 鴻

(濟寧市兗州區(qū)人民醫(yī)院,濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院兗州院區(qū)，濟寧 272100)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第4位、死亡率居第2位[1]。胃癌與遺傳、體質(zhì)等內(nèi)在因素以及生活習慣等外界因素有關(guān)?，F(xiàn)已明確與胃癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的基因有癌基因人表皮生長因子受體2(HER-2)、抑癌基因結(jié)直腸癌缺失基因(deleted colorectal carcinoma，DCC)等。目前發(fā)現(xiàn)DCC基因是最長的抑癌基因，是一種信號傳遞受體[2]。目前研究表明，DCC基因在結(jié)直腸癌等組織表達明顯減少或缺失[3]，但在胃癌中的表達情況還未見報道。HER-2基因是表皮生長因子受體家族成員，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。胃的癌變是一個多因素、多步驟、多階段發(fā)展過程，涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因等。本文研究了胃癌與癌旁正常組織中DCC及HER-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，并與患者臨床及病理特征進行相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2016年6月期間于山東省腫瘤醫(yī)院、濟寧市兗州區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科經(jīng)病理診斷確診的胃癌患者，共52例。其中年齡為32～79歲；其中年齡≥60歲26例，<60歲26例；女18例，男34例。TNM分期參見《胃癌臨床實踐指南》(2013年 第2版)：Ⅰ期12例、Ⅱ期6例、Ⅲ期22例、Ⅳ期12例。標本均取癌旁組織及癌組織，癌旁組織取距腫瘤邊緣5cm以上，癌組織標本取自病灶中央且為非壞死組織。將標本置液氮中速凍后，迅速移入-80°C冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1試劑 RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自美國Promega 公司；Ex Taq酶及附帶緩沖液、dNTPMix、Nuclease-Free Water、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2.2引物設(shè)計和合成 根據(jù)DCC及HER-2基因mRNA序列，利用軟件Primer BLAST (NCBI)設(shè)計PCR引物如下：DCC mRNA上游引物 5’-CACTGCGCTTCCTCTCAGAA-3’，下游引物5’-CTGGCTTGTGGTGTCTGGAA-3’，擴增片段的長度為215bp；HER-2 mRNA上游引物序列為5’-GCCCTCATCCACCATAACAC-3’，下游引物序列為5’-TTCCTCCACGCACTCCTG-3’， 擴增片段的長度為234bp；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物參考文獻[4]，上游引物5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’，下游引物5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3’，擴增片段的長度為589bp。

1.2.3RT-PCR反應(yīng) 提取標本總RNA，合成cDNA； PCR反應(yīng)體系為10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ExTaq酶0.125μl，cDNA模板3μl，Nuclease-Free Water定容至25μl；PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 5min，DCC：(94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 90s)×32個循環(huán)，72℃終延伸10min；HER-2:(94℃ 30s，66℃ 30s，72℃ 45s)×32個循環(huán)，72℃終延伸10min。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射反射儀觀察目的條帶，凝膠圖像分析儀拍照分析。

1.3 DCC及HER-2 mRNA分析

1.3.1采用凝膠圖像分析軟件AlphaView-SA對圖像進行分析處理 分別得到目的基因和GAPDH的積分密度值，扣除背景，得到凈光密度值，然后按照下列公式分別計算目的基因 mRNA含量。目的基因 mRNA含量=(目的基因凈光密度值)/ (GAPDH凈光密度值)

1.3.2基因定性分析 表達陽性為目的基因擴增產(chǎn)物與Mark相對應(yīng)位置出現(xiàn)一條亮帶，反之為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴增結(jié)果

由圖所見，在215bp、234bp和589bp處各顯示電泳條帶，結(jié)果證實為DCC、HER和GAPDH基因。見圖1、2。

注：M,DL2000 DNA Marker；1，3，5:腫瘤組織； 2，4，6:癌旁組織

2.2 癌旁組織和胃癌組織DCC mRNA及HER-2 mRNA的表達

兩者在胃癌及癌旁組織中表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1；DCC mRNA、HER-2 mRNA在胃癌組織轉(zhuǎn)錄水平分別為0.555±0.087、0.950±0.025。

2.3 胃癌組織中DCC mRNA與HER-2mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與臨床病理特征的關(guān)系

同一位患者以正常組織中DCC mRNA表達量為1，計算腫瘤組織中DCC mRNA相對表達量。詳見表2。

表1 胃癌組織及癌旁組織中DCC mRNA、HER-2 mRNA的表達比較

表2 胃癌組織中DCC mRNA及HER-2mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Castets等[5]研究發(fā)現(xiàn)DCC蛋白可通過誘導癌細胞凋亡來抑制結(jié)、直腸惡性腫瘤的發(fā)展，從而起到預(yù)防和治療癌癥的效果。Melen等[6]研究表明，DCC蛋白在配體缺乏的環(huán)境中具有誘導細胞凋亡的作用，但在配體Netorin-1存在時，DCC蛋白則具有抗細胞凋亡作用。如果DCC基因缺失，不能編碼DCC蛋白，細胞生長和分化發(fā)生障礙，細胞有可能發(fā)生惡變[7]。DCC基因在結(jié)、直腸腫瘤細胞中表達下調(diào)，其失活的主要機制是啟動子甲基化和等位基因缺失[8]。有報道顯示，在結(jié)、直腸腫瘤組織中用PCR直接擴增DCC基因某區(qū)域檢測缺失率只有29%[9]。翟保平等[10]發(fā)現(xiàn)DCC基因在乳腺癌組織中的陽性表達率為38.2%，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中陽性表達率為23.3%，認為DCC基因表達下調(diào)與乳腺癌的發(fā)生和侵襲有關(guān)。本文結(jié)果顯示52例胃癌患者中，DCC mRNA檢出率在癌組織中為84.6%，正常組織中為100%，正常組織明顯高于胃癌組織(P<0.05)，與上述報道基本一致。說明胃癌的形成過程中出現(xiàn)了DCC基因表達缺失。

原癌基因HER-2通過基因擴增與過表達，通過一定的信號轉(zhuǎn)導通路，影響細胞增殖、分化、凋亡，使得細胞增殖加速、惡性趨強，并有抗凋亡現(xiàn)象[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺、胃、食管等惡性腫瘤組織中均檢測出HER-2基因的過量表達。本文結(jié)果顯示HER-2 mRNA在52例胃癌患者腫瘤組織檢出率為28.8%，與上述報道基本一致。說明胃癌的形成過程中出現(xiàn)了HER-2基因過度表達，應(yīng)用RT-PCR的檢測方法提高了基因檢測的陽性率，有望為胃癌的診斷提供依據(jù)。

DCC基因mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，HER-2基因mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤漿膜胃癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤漿膜；結(jié)果提示HER-2基因mRNA的過表達與DCC基因mRNA的表達下調(diào)可能促進了胃癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。TNM分期的III期、Ⅳ期胃癌患者中DCC基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于I期、II期患者 (P<0.005)。在低分化(未分化)胃癌患者DCC基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于高分化及中分化胃癌患者(P<0.05)，而HER-2基因mRNA表達無相關(guān)性，提示隨著腫瘤分化程度降低、分期越晚，DCC基因mRNA表達下調(diào)越明顯。我們推測，HER-2的過表達與DCC mRNA表達下調(diào)是胃癌惡性程度增高的標志，但兩者的相關(guān)性還有待進一步研究；同時，增強DCC基因在細胞中的表達，有可能成為胃癌基因治療的措施之一。人源化的HER-2單克隆抗體已成功用于治療晚期乳腺癌。因此，DCC及HER-2雙基因聯(lián)合檢測在胃癌中的研究，可以為胃癌的基因治療提供重要依據(jù).