王海英 亞白柳 王文淼 劉文彥△

(1濟寧醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；2濟寧醫(yī)學院行為醫(yī)學重點實驗室，濟寧 272067)

針刺在中國已經(jīng)應用了數(shù)千年，是中國傳統(tǒng)醫(yī)術的一種。電針是結合了現(xiàn)代技術后的產(chǎn)物，它是指在毫針針刺的基礎上輸入脈沖電流[1]，來達到治病的目的[2]。電針技術已廣泛應用到缺血性腦損傷的臨床治療中。缺血性腦損傷的發(fā)病率高，其死亡率已居于我國疾病死亡原因的前6位[3]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對機體的內(nèi)、外環(huán)境的變化極為敏感，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 ( glucose regulated protein,GRP78)通常被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志物，可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的修飾和正確折疊，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能具有保護作用[4]；caspase12是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的促凋亡因子，正常狀態(tài)下與GRP78結合，而過強的刺激可使caspase12激活，啟動凋亡通路[5]。本實驗通過觀察電針對大鼠腦缺血-再灌注不同時間的GRP78和caspase12表達的變化以及肢體運動功能的修復情況，探討電針的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級SD大鼠，雄性，體重(220±10)g，購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號：SCXK魯20130001)。實驗動物于術前自由喂食和飲水，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，恒定濕度(50±5)%，12h循環(huán)光照，以維持基礎狀態(tài)。所有動物實驗均遵循國家實驗動物飼養(yǎng)管理條例和使用指南以及濟寧醫(yī)學院實驗動物管理條例。caspase12 mRNA RT-PCR擴增和GRP78免疫熒光實驗(只有3h、6h、12h和24h組)：SD大鼠隨機分為對照組(sham組，5只)、腦缺血-再灌注組(I/R組，30只)和再灌注時間點+電針組(I/R+EA組，30只)，I/R組按再灌注時間點分為3h、6h、12h、24h、72h、120h 6個亞組，每組5只，I/R+EA組根據(jù)I/R各亞組時間點對應分為6組，每組5只。大鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀實驗：35只SD大鼠隨機分為sham組(5只)、I/R組(15只)和I/R+EA組(15只)，I/R組和I/R+EA組根據(jù)時間點7d、14d和30d各分為3個亞組，每組5只。

1.2 方法

1.2.1動物模型的制備[6]制備MCAO模型，按照Longaⅴ級評分法于術后清醒1h后給實驗動物評分，1～3分的動物為模型制備成功。

1.2.2電針方法[7]大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，于再灌注開始后30min，對“水溝”和“百會”穴進行電針刺激，持續(xù)30min，最后一次電針結束后30min取材。

1.2.3肢體運動功能修復[8]各組實驗動物于術后3h統(tǒng)一進行評分，選擇評分4～5級的大鼠為疲勞棒實驗模型成功動物，I/R+EA組大鼠每天電針治療1次、30min，連續(xù)電針干預7d，對再灌注7d、14d和30d組的大鼠進行疲勞轉(zhuǎn)棒儀實驗，40轉(zhuǎn)/min，各組分別于術前進行訓練，選擇能在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上停留2min以上的大鼠，分別于術后第2天開始，每天訓練2次，分別于再灌注7d、14d和30d進行疲勞轉(zhuǎn)棒測試，每只大鼠測5次，記錄大鼠在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間，取平均值，最長停留時間為15min即停止疲勞轉(zhuǎn)棒儀，觀察大鼠肢體運動功能恢復狀況。

1.2.4RT-PCR檢測caspase12 mRNA 用DNAstar軟件設計引物，引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 caspase12 mRNA引物序列

1.2.5GRP78免疫熒光實驗 制備冰凍切片，厚度12 μm，加入GRP78一抗工作液，4℃過夜，加入熒光二抗，PI工作液室溫復染，激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標記的陽性反應物[8]。FITC是波長為488 nm藍色激發(fā)光，波長為515 nm的綠色觀測光。每個鼠腦標本選取不連續(xù)的4張切片，每張切片計數(shù)4個視野， 取細胞計數(shù)的平均值進行統(tǒng)計學分析[9]。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠肢體運動功能指標變化

I/R+EA組(7 d和14 d)大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間與對應的I/R組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；I/R+EA組(30 d)大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間與對應I/R組相比變化不明顯(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間(秒，

2.2 各組大鼠腦組織caspase12 mRNA表達情況

與sham組相比，腦缺血-再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h后大鼠腦組織中caspase12在mRNA水平上的表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；電針干預后caspase12 mRNA的表達與I/R組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

2.3 大鼠腦組織GRP78的表達情況

3h、6h 、12h、24h I/R+EA組大鼠缺血部位腦組織GRP78陽性細胞數(shù)和對應的I/R組比較顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表4。

表3 3組間caspase12 mRNA的表達

注：胞漿內(nèi)GRP78陽性呈綠色，60×，1為sham組； 2、3、4和5為3 h、6 h、12 h和24 hI/R組；6、7、8和9為對應時間點I/R+EA組。

表4 3組間GRP78陽性細胞數(shù)比較(個/視野，

3 討論

腦血管病是臨床上的常見病，其中缺血性腦卒中所占的比例最高，嚴重危害了人類生命及健康。近幾年，對于缺血性腦卒中的治療及機制方面的研究取得很大的進展[10]。腦缺血區(qū)分為急性缺血中心區(qū)和周圍缺血半暗區(qū)[11]，腦缺血損傷側(cè)大腦半暗帶廣泛存在凋亡現(xiàn)象，以缺血損傷側(cè)大腦皮層及紋狀體為甚，神經(jīng)元對缺氧刺激因素比較敏感，可發(fā)生神經(jīng)細胞壞死。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是細胞內(nèi)重要的細胞器，參與機體許多重要生理功能的維持，包括信號肽的識別、糖基化修飾以及細胞內(nèi)Ca2+超載等[9,12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常敏感，當細胞內(nèi)發(fā)生一系列反應時，都可以導致ER功能障礙，比如：糖基化抑制、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運異常[13]、二硫鍵形成障礙等，即發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[14]。在許多分子伴侶蛋白的協(xié)助下，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可以發(fā)生正確折疊，其中，分子伴侶蛋白包括Bip/Grp78(immunoglobulin binding protein78)和Grp94(glucose-regulated protein94)等。Hayashi 等[15]認為,GRP78 而非GRP94決定了神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激能促進IRE1介導的轉(zhuǎn)錄因子CHOP基因表達和caspase12的激活，參與凋亡的過程[16]。

疲勞轉(zhuǎn)棒儀實驗能通過對大鼠運動功能的測試，觀察大鼠肢體運動功能修復狀態(tài)，包括大鼠運動協(xié)調(diào)能力和肢體力量，是反應神經(jīng)功能的修復情況的很好的行為學指標。本文結果顯示，電針干預可以幫助大鼠修復肢體的運動功能及肢體協(xié)調(diào)能力，從而促進大鼠神經(jīng)功能恢復；腦缺血-再灌注損傷后腦組織中caspase12在mRNA表達上調(diào)，所對應的再灌注時間點，經(jīng)電針干預后caspase12 mRNA的表達明顯降低；腦缺血-再灌注損傷后大鼠腦細胞GRP78表達明顯升高，電針干預后GRP78的表達顯著降低；電針干預后能下調(diào)缺血側(cè)腦組織中GRP78和caspase12 mRNA的表達。GRP78和caspase12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關蛋白，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的凋亡通路的關鍵因子，GRP78的過度表達能使神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性增強，加速神經(jīng)元的損傷；caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面，能與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子協(xié)同，最終導致細胞凋亡；最新的研究顯示，caspase12也能獨立引發(fā)細胞凋亡。因此，我們推斷電針促進缺血性腦損傷大鼠肢體運動功能修復可能與阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的凋亡通路有關。

綜上所述，電針干預能通過降低腦細胞內(nèi)caspase12 mRNA和GRP78的表達幫助修復大鼠肢體的運動功能，發(fā)揮腦保護作用，為探討電針治療缺血性中風的作用機制提供了有效的實驗依據(jù)。