肖靖杰，張治平，王 洋，司 超，張 亮，張 偉，李 麗，李新芝，馬克濤

(石河子大學醫(yī)學院：1. 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室；2. 生理學教研室；3. 第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科；4. 第一附屬醫(yī)院老干二科；5. 病理生理學教研室，新疆石河子 832000)

研究表明，內(nèi)耳循環(huán)系統(tǒng)紊亂與突發(fā)性耳聾、Meniere綜合征、老年性聽力喪失及耳毒性藥物誘發(fā)的聽力喪失等密切相關[1-3]。由于聽覺在傳導過程中的高耗能，螺旋動脈的血流供應對維持聽覺器官的功能有著重要的作用。

耳蝸螺旋動脈(spiral modiolar artery, SMA)是供應耳蝸血流的唯一動脈，其上游動脈依次是小腦前下動脈和腦基底動脈，而小腦前下動脈有兩個功能性的終末分支，分別是前庭耳蝸支和螺旋動脈支。因此，當SMA發(fā)生異常變化如血管痙攣等時，將會導致耳蝸血流供應減少甚至完全中斷，引起內(nèi)耳血液循環(huán)紊亂及耳蝸功能失調(diào)，出現(xiàn)眩暈和耳鳴等癥狀[4]。所以，SMA的血流供應對維持正常聽力十分重要。血管主要由內(nèi)層的內(nèi)皮細胞、中層的平滑肌細胞及外層的成纖維細胞組成，通常認為，血流是由血管直徑來控制的，血管的直徑又是由血管平滑肌細胞的收縮狀態(tài)來控制的[5]。由于SMA只有左右各一支，樣本量少，不能滿足相關實驗的研究，所以建立血管平滑肌細胞的體外模型對于內(nèi)耳循環(huán)系統(tǒng)紊亂導致的病理生理變化及相關疾病的病因機制研究很有意義。雖然平滑肌細胞的培養(yǎng)方法已經(jīng)十分成熟，但是由于不同器官或組織的血管間結構和功能存在著較大差異，且前期研究發(fā)現(xiàn)耳蝸螺旋動脈平滑肌細胞靜息膜電位呈現(xiàn)獨特的雙峰分布[6-7]。因此，從其他器官或組織得出的結論并非完全適用于內(nèi)耳循環(huán)系統(tǒng)。本實驗經(jīng)過反復嘗試，最終聯(lián)合應用了酶消化法和直接貼壁法這2種常用的方法培養(yǎng)出了大量耳蝸螺旋動脈平滑肌細胞，經(jīng)鑒定，其純度高，生長狀況良好。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 出生約2周，體質(zhì)量145～185 g的豚鼠，雌雄不拘，購于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，動物使用許可證批號：SCXK新(2003-0001)，動物質(zhì)量符合一級標準。飼養(yǎng)和實驗研究過程均嚴格遵守《石河子大學醫(yī)學倫理委員會條例》。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素(美國Hyclone公司)，平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)抗體(美國abcam公司)，GAPDH一抗、二抗、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)，BSA(美國Blotopped公司)，DAPI(北京Solarbio公司)，PBS、Triton-x-100(上海生工)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)，倒置相差顯微鏡(美國Motic公司)，電泳儀、電轉膜儀、GEL-DOC2000凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1 原代培養(yǎng) 豚鼠5只，100 mL/L水合氯醛麻醉后斷頭處死，無菌條件下取下顳骨，生理鹽水中打開聽泡，在鏡下取出耳蝸，剝離耳蝸外側壁的血管紋毛細血管網(wǎng)和螺旋韌帶，小心分離出SMA及其主要分支。將分離出的SMA及其分支放入預冷的不含Ca2+和Mg2+的Hank’s液中漂洗2～3次，移入無菌臺操作。

將SMA移入裝有Hank’s液的培養(yǎng)皿中，剪成3～5 mm大小的片段，然后將血管片段放入濃度為1.25 g/L的胰蛋白酶中，置于CO2培養(yǎng)箱中消化20 min，每隔5 min輕輕晃動培養(yǎng)皿，并輕輕吹打3～4次，消化完成后，立即終止消化；1 000 r/min離心5 min。棄上清液，剩余血管片段加入幾滴含200 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，輕輕混勻，均勻鋪在培養(yǎng)皿中。血管片段間隙為2～3 mm，培養(yǎng)皿倒扣置于培養(yǎng)箱中2 h。2 h后，翻轉培養(yǎng)皿，加入含200 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱中，靜置3 d。在第4天可以進行首次換液，在第6～8天可見細胞由組織邊緣長出，大約3周可以長滿培養(yǎng)皿，并進行首次傳代。

1.2.2 細胞傳代 當細胞生長密度達到80%～90%時，可進行傳代[8]。棄培養(yǎng)基，PBS洗2～3遍，取質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶(含0.2 g/L EDTA)進行消化，鏡下可見細胞邊緣折光增強，成片皺縮變圓且細胞間隙逐漸變大。當見細胞大部分脫落時立即終止消化，并夾棄較大的血管片段，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上層液，加入培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，分別移入2個新的35 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細胞純化 由于SMA直徑小，不容易去除內(nèi)膜和外層的纖維層，所以在細胞傳代的過程中，根據(jù)成纖維細胞和血管平滑肌細胞不同的貼壁時間采取了自然純化法和差異貼壁法對細胞進行了純化。另有文獻報道，成纖維細胞的貼壁能力大于平滑肌細胞，而平滑肌細胞大于內(nèi)皮細胞[9]。同時，由于內(nèi)皮細胞需要的培養(yǎng)條件較高，在上述的培養(yǎng)條件下無法存活[10]。根據(jù)上述規(guī)律，在傳代時，首先將細胞懸液移入35 mm的培養(yǎng)皿中，靜置30 min，使部分細胞貼壁，然后吸取上層細胞懸液移入另一個新的培養(yǎng)皿中，再次靜置30 min，最后吸取第2個皿中的細胞懸液移入第3個培養(yǎng)皿中，收集第3個培養(yǎng)皿中的細胞即可獲得較純的平滑肌細胞。

1.2.4 細胞鑒定 形態(tài)學觀察：應用倒置相差顯微鏡觀察并拍照記錄細胞的大小、形態(tài)、生長方式及肌絲排列特點等。

細胞免疫熒光染色：取第4代處于對數(shù)生長期的細胞均勻種植到放置了玻片的6孔板中，使細胞爬片。3 d后，棄培養(yǎng)基，37 ℃預溫的PBS洗3次，5 min/次；40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次；2 g/L Triton-x-100透化細胞3 min，PBS洗3次；50 g/L BSA 37 ℃恒溫箱封閉30 min，PBS洗3次。加入α-SM-actin一抗，濕盒置入4 ℃冰箱中過夜。次日，37 ℃恒溫箱復溫30 min，PBS洗3次。暗室中，加入二抗，37 ℃恒溫孵育1 h，PBS洗3次，DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片，應用激光共聚焦顯微鏡采像，分析結果。

細胞免疫組化染色：細胞爬片，透化，30 mL/L H2O2-甲醇封閉5 min，PBS洗3次。加入α-SM-actin一抗，4 ℃過夜。PBS洗3次，滴加二抗類似物(山羊抗兔IgG/HRP聚合物)，37 ℃孵育15～20 min，PBS洗3次，DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，自來水反藍，中性樹膠封片，采像。

Western blot：分別收集第4～6代細胞，裂解并提取總蛋白質(zhì)，BCA法測蛋白濃度。加入適量上樣緩沖液煮沸，凍存?zhèn)溆?。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后轉至硝酸纖維素膜，50 g/L BSA封閉2 h，加入α-SM-actin(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗(1∶20 000)室溫孵育2 h，于暗室中滴加發(fā)光試劑，壓片，顯影，定影，采集圖像后用軟件Quantity One進行分析。

2 結 果

2.1細胞培養(yǎng)SMA血管片段貼于培養(yǎng)皿6 d后，約85%的組織塊存活，鏡下可觀察到大量細胞從組織塊邊緣游離出來(圖1A)。至10 d左右，隨著細胞的增殖，培養(yǎng)皿內(nèi)可見大量平行生長的細胞，18 d左右可見細胞鋪滿皿底(圖1B)。細胞大小形態(tài)不一，呈梭形、三角形或帶狀，有長短不一的胞突，胞質(zhì)豐富，胞核呈卵圓形，居中，部分可見雙核甚至多核(圖1C)。細胞密度較低時，常交織成網(wǎng)狀，而培養(yǎng)至22 d左右，細胞密度較高，呈螺旋狀或柵欄狀，表現(xiàn)為典型的“峰-谷”樣生長(圖1D)。利用細胞的生長特點進行反復的純化，平滑肌細胞的純度越來越高，第4代后可達95%以上。

2.2平滑肌細胞的鑒定

2.2.1 細胞免疫熒光染色 取第4代的細胞，爬片后經(jīng)平滑肌細胞特異的肌動蛋白(α-SM-actin)抗體進行細胞免疫熒光染色，結果顯示肌動蛋白陽性表達率達95%(圖2A)。經(jīng)DAPI染核，胞核呈藍色(圖2B)。圖2A和圖2B Merged后(圖2C)。

圖1SMA平滑肌細胞的生長過程

Fig.1 Growth process of VSMCs (×100)

A：培養(yǎng)第6天，細胞爬出；B：培養(yǎng)第18天，細胞鋪滿皿底；C：細胞呈梭形、三角形或帶狀；D：細胞呈典型的“峰-谷”樣生長。

圖2平滑肌細胞的免疫熒光染色

Fig.2 VSMCs stained by α-SM-actin immunofluorescence (×200)

A：平滑肌細胞α-SM-actin免疫熒光染色；B：DAPI染核；C：A和B合并。

2.2.2 細胞免疫組化染色 取第4代的細胞，爬片后經(jīng)肌動蛋白抗體進行免疫組化染色(圖3)，鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含大量棕黃色的α肌動蛋白絲，呈線性排列且與細胞長軸平行，細胞核呈卵圓形，居中。

圖3平滑肌細胞的免疫組化染色

Fig.3 VSMCs stained by α-SM-actin immunocytochemistry

A：平滑肌細胞α-SM-actin免疫組化染色(×100)；B：鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)含大量棕黃色的α肌動蛋白絲(×250)。

2.2.3 Western blot檢測平滑肌肌動蛋白的表達 收集第4～6代的細胞，裂解并提取總蛋白，Western blot檢測平滑肌特異性的α-SM-actin的表達情況，結果顯示其均呈陽性表達，且各組之間均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4)。

圖4平滑肌細胞肌動蛋白的表達情況

Fig.4 VSMCs stained by Western blot

3 討 論

眾所周知，SMA是供應耳蝸血流的唯一動脈，其在蝸軸內(nèi)螺旋上升，在耳蝸外側壁主要分成血管紋毛細血管網(wǎng)和螺旋韌帶毛細血管網(wǎng)，其中血管紋中的毛細血管最密集[11]。由于SMA是供應耳蝸血流的唯一動脈，且其側枝循環(huán)較少，一旦發(fā)生堵塞，不易代償，可造成耳蝸微循環(huán)的障礙及病理性的損害。因此，SMA的血流供應對維持正常聽力十分重要。大量證據(jù)表明，內(nèi)耳循環(huán)系統(tǒng)紊亂與突發(fā)性耳聾、Meniere綜合癥、老年性聽力喪失、耳毒性藥物誘發(fā)的聽力喪失及增加噪聲的敏感性等密切相關?？傊?，SMA平滑肌細胞的培養(yǎng)對于研究其相關疾病的病理生理過程具有重要意義。

由于SMA細小，分離困難，就目前而言缺乏簡單經(jīng)濟的平滑肌細胞培養(yǎng)方法，因而大大制約了對其相關病理生理變化的研究。本實驗詳細描述了SMA的分離，原代細胞的培養(yǎng)、純化及鑒定的方法，從而建立了一種簡單經(jīng)濟又高效的SMA平滑肌細胞的培養(yǎng)方法。實驗發(fā)現(xiàn)，6 d左右組織塊邊緣有平滑肌細胞游離出來，18 d左右鋪滿皿底，第3代即可得到較純的平滑肌細胞。經(jīng)過鑒定，在形態(tài)上，細胞呈典型的“峰-谷”樣生長，經(jīng)免疫熒光及組化染色，第4代細胞的肌動蛋白陽性表達率達95%，而Western blot結果亦同樣顯示肌動蛋白呈陽性表達。

在培養(yǎng)SMA平滑肌細胞的過程中，最大的問題就是細胞的純化，即如何去除混雜在其中的內(nèi)皮細胞和成纖維細胞。有文獻報道，酶消化法和組織貼塊法是培養(yǎng)平滑肌細胞最常用的2種方法[12-13]。其中，酶消化法培養(yǎng)細胞周期雖然較短, 但消化酶作用的時間和濃度不易掌握(酶消化時間過短或酶濃度過低時消化不完全，酶消化時間過長或酶濃度過高時易造成細胞損傷)，且酶本身對細胞就有一定的毒性作用；相比較而言，組織貼塊法操作簡便，不易發(fā)生污染，但培養(yǎng)周期較長。微小動脈的血管是由三層細胞組成的：外層的成纖維細胞、中間層的平滑肌細胞和內(nèi)層的內(nèi)皮細胞。培養(yǎng)大血管平滑肌細胞時，可以通過機械刮除的方式去除成纖維細胞和內(nèi)皮細胞，但SMA較細小，不宜采用上述方式。所以經(jīng)過嘗試，本實驗最終選擇將2種方法聯(lián)合使用。

另外，實驗中有以下幾個關鍵步驟需要注意：①動物選擇時，由于豚鼠具有與人類類似的耳蝸解剖結構，在相同條件下，年幼豚鼠的組織塊較年長豚鼠有更好的增殖潛能，在保證組織足夠的情況下，本實驗選用了2周齡左右新生豚鼠；②豚鼠耳蝸外側壁主要是血管紋毛細血管網(wǎng)和螺旋韌帶毛細血管網(wǎng)，分離SMA時動作一定要輕柔，避免因?qū)ρ苓^度牽拉而造成的損傷；③細胞生長具有密度依賴性，組織塊大小以1 mm2為宜，間距為2～3 mm，以保證細胞有足夠的生長空間且能保持合適的生長密度；④組織貼塊時，培養(yǎng)皿倒扣的時間為2 h，時間過短貼壁不牢，過長則會導致組織塊干涸；⑤原代細胞培養(yǎng)時選用含200 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基，血清濃度過低會降低培養(yǎng)的成功率，而傳代培養(yǎng)時，開始幾代血清濃度可降為150 mL/L，以后傳代則為100 mL/L。

內(nèi)耳血液循環(huán)紊亂導致的Meniere綜合征、老年性聽力喪失及耳毒性藥物誘發(fā)的聽力損傷等已經(jīng)成為困擾人類的又一難題，而本研究所介紹的SMA平滑肌細胞培養(yǎng)方法較為成熟，可為內(nèi)耳循環(huán)系統(tǒng)紊亂導致的病理生理變化的體外研究及血管平滑肌藥物評價提供一個理想的實驗材料。