杜 媛，羅 玲，王 婭，韓 秀，韓 克，馬愛群

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)是一種心肌肌小節(jié)蛋白基因突變的常染色體顯性遺傳性疾病，以心室肌肥厚(尤其是室間隔非對(duì)稱性肥厚)為特征，常表現(xiàn)為心律失常、運(yùn)動(dòng)耐量受損及猝死，是兒童和青少年猝死的常見原因之一[1]。流行病學(xué)研究顯示，普通人群中HCM的發(fā)病率至少為0.2%，其中50%以上的患者具有明顯的家族聚集傾向，表型呈現(xiàn)出多樣性，且同一家族亦有較大異質(zhì)性[2]。迄今已確定至少30個(gè)基因的1 500多種突變與家族性HCM相關(guān)[3-4]。然而，絕大多數(shù)新診斷HCM患者或家系的遺傳背景仍不明確，如何高效、快捷地確定其突變基因?qū)τ诨颊叩脑\療尤為重要?；驒z測有助于HCM的早期診斷，但一代測序技術(shù)存在檢出率低、成本高等不足。近年來，二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)以其高通量、高效、價(jià)廉等特點(diǎn)促進(jìn)了遺傳性疾病的致病基因篩查研究[5-6]。本研究擬應(yīng)用NGS技術(shù)結(jié)合Sanger測序法對(duì)1個(gè)HCM伴房顫家系進(jìn)行分析，探討可能的遺傳背景。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象入選2015年2月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的HCM伴房顫先證者及其家系成員共14例。HCM診斷參照2014年歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESC)HCM診斷與治療指南[3,7]，包括心動(dòng)超聲顯示舒張末期心室某一節(jié)段或者多個(gè)節(jié)段室壁厚度≥15 mm，或間隔與后壁的室壁厚度比值>1.3，除外高血壓等引起繼發(fā)性心肌肥厚的因素及其他心血管系統(tǒng)疾病。收集入選者包括一般查體、心電圖和超聲心動(dòng)圖等臨床資料。對(duì)照為100例正常健康志愿者，各項(xiàng)檢查均未見異常。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2HCM捕獲芯片設(shè)計(jì)該捕獲芯片包含168個(gè)與HCM相關(guān)的基因。捕獲探針由美國Agilent公司設(shè)計(jì)，覆蓋上述基因的全部外顯子區(qū)域及相鄰內(nèi)含子區(qū)域(50 bp)。

1.3遺傳基因篩查提取先證者外周血基因組DNA，構(gòu)建DNA文庫，以目標(biāo)序列捕獲聯(lián)合NGS技術(shù)的方法進(jìn)行基因檢測。篩選獲得的遺傳變異均通過Sanger測序法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4生物信息分析采用SIFT、PolyPhen2、Mutation Taster等軟件預(yù)測單核苷酸改變對(duì)蛋白功能的影響。

2 結(jié) 果

2.1患者家系一般臨床情況該家系中先證者為59歲女性(Ⅱ-2)，于2年前被診斷為HCM(圖1A)?；颊哂嘘嚢l(fā)性心悸、勞累性呼吸困難及胸痛的癥狀，NYHA心功能分級(jí)為Ⅱ級(jí)，無眩暈、暈厥等不適；無高血壓、糖尿病等其他心血管疾病。心動(dòng)超聲提示不對(duì)稱性心肌肥厚，室間隔最大厚度15 mm，左室后壁厚度9 mm，收縮期二尖瓣前移征象(SAM征)陰性，左房前后徑30 mm，左室舒張末期前后徑48 mm，射血分?jǐn)?shù)(EF)61%。心電圖示竇性心律、左室肥厚(圖1B)，心率為50次/min，這可能與患者長期服用美托洛爾有關(guān)?；颊咴V曾行動(dòng)態(tài)心電圖發(fā)現(xiàn)陣發(fā)性心房顫動(dòng)(資料未提供)。

圖1家系圖及先證者心電圖

Fig.1 Pedigree of the family and the proband’s ECG

A：家系圖；B：先證者心電圖。

先證者父親(Ⅰ-1)有多年的活動(dòng)后氣短病史。9年前因房顫伴Ⅲ度房室傳導(dǎo)阻滯植入永久VVI起搏器，當(dāng)時(shí)心臟情況不詳(未能提供資料)。此次訪視心動(dòng)超聲顯示左室心腔明顯擴(kuò)大，心臟收縮功能輕度下降(EF 45%)，室間隔厚度正常范圍(表1)。

先證者母親無臨床癥狀，既往有高血壓病史，經(jīng)藥物控制血壓良好。心動(dòng)超聲示左房、左室輕度擴(kuò)大，未見心肌肥厚。其心電圖為完全性右束支傳導(dǎo)阻滯。

先證者的二妹(Ⅱ-6)有明顯氣短、胸痛病史，NYHA心功能分級(jí)為Ⅱ級(jí)。其心電圖示心房顫動(dòng)和左室肥厚。心動(dòng)超聲顯示明顯的室間隔肥厚，二尖瓣輕度反流，可見SAM征，安靜狀態(tài)下左室流出道壓力階差為40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，行Valsalva動(dòng)作后該值升至65 mmHg。

先證者的三妹(Ⅱ-8)于5年前被診斷為風(fēng)濕性心臟瓣膜病。此次訪視心動(dòng)超聲顯示二尖瓣重度狹窄伴輕度反流，左房巨大(LA 70 mm)。該患者有長期的氣短病史，但拒絕行換瓣手術(shù)。

先證者的女兒(Ⅲ-2)和外甥(Ⅲ-4)曾在外院行心動(dòng)超聲檢查后診斷為HCM，但2人均無相應(yīng)臨床表現(xiàn)，心電圖為竇性心律。家系內(nèi)其余親屬平素?zé)o臨床癥狀，其心電圖和心動(dòng)超聲均正常。

表1家系成員臨床特征

Tab.1 Clinical characteristics of the family members

家系成員ID年齡/性別心動(dòng)超聲LAD (mm)LVEDD(mm)IVST(mm)LVPWT(mm)LVEF(%)心電圖癥狀PRDM16基因Ⅰ-178/M586810845AF、Ⅲ度AVB、起搏器植入心悸、心絞痛、呼吸困難-Ⅰ-279/F36539866竇性節(jié)律、RBBB無-Ⅱ-259/F325115961陣發(fā)性AF呼吸困難p.G1042RⅡ-453/F31488865竇性節(jié)律無-Ⅱ-648/F374125966AF心絞痛、呼吸困難p.G1042RⅡ-842/F70568868AF呼吸困難p.G1042RⅡ-941/M32508864竇性節(jié)律無-Ⅲ-133/F28487871竇性節(jié)律無-Ⅲ-228/F294714869竇性節(jié)律無p.G1042RⅢ-326/M30499972竇性節(jié)律無-Ⅲ-422/M334216967竇性節(jié)律無p.G1042RⅢ-517/M28478871竇性節(jié)律無-Ⅲ-612/F25446675竇性節(jié)律無-Ⅲ-716/M27477773竇性節(jié)律無-

LAD：左心房直徑；LVEDD：左心室舒張末期內(nèi)徑；IVST：舒張期末室間隔厚度；LVPWT：左心室后壁厚度；LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；AF：房顫；AVB：房室傳導(dǎo)阻滯； RBBB：右束支傳導(dǎo)阻滯。M：男性；F：女性。

2.2基因測序結(jié)果二代測序結(jié)果顯示先證者攜帶PRDM16基因c.3124G>A雜合突變，該錯(cuò)義突變c.3124G>A突變位于PRDM16基因第14個(gè)外顯子，導(dǎo)致編碼的1 042位甘氨酸(Gly)突變?yōu)榫彼?Arg)，即p.G1042R(圖2A)。Sanger測序發(fā)現(xiàn)先證者的2個(gè)妹妹(Ⅱ-6和Ⅱ-8)以及先證者的女兒和外甥(Ⅲ-2和Ⅲ-4)均攜帶該突變，家系中其他成員及100例健康個(gè)體中未發(fā)現(xiàn)該突變。先證者父母親均未攜帶該突變，考慮該突變?yōu)樾律蛔?。此外，氨基酸序列分析顯示PRDM16蛋白1042位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的氨基酸在不同物種之間具有保守性(圖2B)，提示該位點(diǎn)突變后的重要性。

2.3生物信息學(xué)分析PRDM16基因c.3124G>A突變導(dǎo)致1042位點(diǎn)氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼?，?dǎo)致突變體較野生型體積增大，由突變前不帶電變?yōu)橥蛔兒髱д姲被釟埢４送?，突變點(diǎn)位于SKI作用區(qū)以及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β調(diào)節(jié)區(qū)，突變后可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的異常。該突變在HGMD數(shù)據(jù)庫中未見報(bào)道，采用多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)PRDM16基因c.3124G>A(p.G1042R)突變可能為有害突變，主要通過影響蛋白功能而致病(表2)。

3 討 論

HCM是一種有多種臨床和基因表現(xiàn)的復(fù)雜性疾病，本研究采用二代基因測序發(fā)現(xiàn)1個(gè)HCM伴房顫的家系中存在PRDM16基因突變(c.3124G>A[p.G1042R])，生物信息學(xué)預(yù)測提示該突變可能是新的致病基因。

PRDM16基因位于染色體1p36.32，編碼PR結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白(PR domain zinc finger protein 16, PRDM16蛋白)[8]。在胎兒和成年人心臟中，PRDM16位于心肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核，有助于維持哺乳動(dòng)物異染色質(zhì)和核纖層結(jié)構(gòu)的完整性[9]，而PRDM16突變小鼠有明顯的心室發(fā)育不全[10]。目前，已有報(bào)道PRDM16突變可能與家族性擴(kuò)張型心肌病及左心室致密化不全有關(guān)[11]，但HCM中尚未見PRDM16基因異常報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)的PRDM16-p.G1042R突變經(jīng)多種生物信息學(xué)軟件分析，提示該突變通過影響蛋白功能而致病，可能為有害突變。但該突變位點(diǎn)具體如何影響PRDM16蛋白的功能、進(jìn)而導(dǎo)致HCM，尚需要進(jìn)

圖2PRDM16p.G1042R雜合突變位于保守區(qū)

Fig.2 Heterozygous mutation p.G1042R of PRDM16 located in the conservation area

A：電泳圖顯示3 124位點(diǎn)堿基由G雜合突變?yōu)锳(c.3124G>A)，導(dǎo)致1 042位點(diǎn)氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼?p.G1042R)；B：序列比對(duì)顯示PRDM16蛋白第1 042位點(diǎn)氨基酸(紅色)為保守位點(diǎn)。

表2生物信息學(xué)軟件預(yù)測PRDM16-G1042R突變的致病性結(jié)果

Tab.2 Pathogenic effect of PRDM16-G1042R mutation predicted by bioinformatics software

預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)果積分備 注PolyPhen-2最可能有害0.999從0.000(最可能良性)到1.000(最可能有害)PROVEAN有害-3.157預(yù)設(shè)值為-2.5,≤-2.5(有害),>-2.5(中性)SIFT影響蛋白功能0.010范圍0～1,≤0.05(有害),>0.05(可耐受)MutationTaster致病基因0.999可能性接近1提示預(yù)測價(jià)值高

一步研究確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)PRDM16突變可導(dǎo)致心臟收縮功能不全、心肌細(xì)胞部分解耦聯(lián)以及心肌增殖能力受損[11]。體內(nèi)激活或抑制PRDM16活性可破壞細(xì)胞增殖和分化之間的微妙平衡[10]。PRDM16相關(guān)性心肌病的基礎(chǔ)機(jī)制為心臟發(fā)生過程中心肌細(xì)胞增殖能力受損，后者與TGF-β信號(hào)通路有關(guān)[10]。

本研究中的家系內(nèi)，數(shù)個(gè)攜帶有PRDM16-p.G1042R突變的家庭成員合并有房顫病史，因此，同時(shí)檢測了30多個(gè)與家族性房顫相關(guān)的基因，但均無陽性發(fā)現(xiàn)。據(jù)此推測房顫繼發(fā)于HCM。既往國外報(bào)道約20% HCM患者合并房顫[12]，我國伍熙等學(xué)者報(bào)道梗阻性HCM患者中合并房顫的比例為17.5%[13-14]。與HCM相關(guān)的解剖及生理學(xué)改變包括：心臟舒張功能下降、心肌缺血及心肌自律性紊亂等均可促進(jìn)房顫的發(fā)生、發(fā)展[15]。

本研究中先證者及其2個(gè)妹妹均攜帶PRDM16-p.G1042R突變，且其女兒及外甥也攜帶該突變，但其父母及100例健康對(duì)照均未檢測到，考慮該突變可能為新生突變[16]。由于先證者及其2個(gè)妹妹均攜帶該突變，故推測對(duì)于先證者父親或母親來說，PRDM16應(yīng)該是一個(gè)生殖細(xì)胞嵌合體，突變只存在于生殖細(xì)胞，體細(xì)胞中不攜帶，故該突變可遺傳給下一代，而在父母親的外周血中不能檢測到。

本研究家系中PRDM16-p.G1042R突變的外顯率是80%(5個(gè)突變攜帶者中有4個(gè)可診斷為HCM)。先證者的三妹(Ⅱ-8)攜帶該突變，但心動(dòng)超聲未見HCM，而是風(fēng)濕性瓣膜病表現(xiàn)，其原因可能是該患者雖為基因攜帶者，但無HCM表型表達(dá)，也可能是后天的風(fēng)濕性瓣膜病引起的血流動(dòng)力學(xué)異常所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)改變而掩蓋了HCM的表現(xiàn)。多種因素決定著基因的外顯率和表現(xiàn)度，遺傳學(xué)病因、背景修飾基因以及血流動(dòng)力學(xué)等相互作用共同促成表型的發(fā)展[17-18]。因此，詳細(xì)的臨床評(píng)估及基因檢測有助于識(shí)別那些無表型表達(dá)的突變攜帶者。此外，因?yàn)樾律蛔兊木壒剩瑢?duì)于那些沒有HCM家族史的個(gè)體或散發(fā)患者也應(yīng)進(jìn)行基因篩查。因此，2014年ESCHCM診斷和管理指南推薦對(duì)滿足HCM診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者應(yīng)進(jìn)行遺傳檢測，以幫助對(duì)其親屬進(jìn)行逐層遺傳篩查[3]。

綜上，本研究在1個(gè)HCM伴房顫的家系中發(fā)現(xiàn)PRDM16-p.G1042R雜合突變，該突變所在區(qū)域在不同種系間高度保守，經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測該突變可能通過影響蛋白功能而致病，提示該突變位點(diǎn)可能是該HCM家系的致病基因。