吳叢珊，斯 巖，童厚超，莊 茜，蔡晶昇，沈美萍

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科，江蘇南京 210029；2. 南京醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院普外科，江蘇南京 210000)

臨床上甲狀腺癌最常見(jiàn)的類型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)，占甲狀腺癌的80%～90%，而且甲狀腺癌的發(fā)病率日益攀升，成為頭頸部腫瘤的常發(fā)病癥[1-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)的一級(jí)結(jié)構(gòu)由200多個(gè)核苷酸殘基組成，過(guò)去常常被認(rèn)為沒(méi)有生物學(xué)功能，僅作為聚合酶轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物而存在。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，且廣泛參與腫瘤的病理過(guò)程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs表達(dá)異常與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[5]。DOCK9-AS2是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，目前有關(guān)DOCK9-AS2在PTC內(nèi)的表達(dá)變化和機(jī)制尚不明確。本研究擬檢測(cè)DOCK9-AS2的表達(dá)并進(jìn)行CCK8和劃痕實(shí)驗(yàn)，分析DOCK9-AS2在PTC細(xì)胞增殖、遷移等過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1一般資料將2016年6月-2017年6月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科收治的PTC患者62例作為研究對(duì)象，其中男性16例、女性46例，年齡31～67歲，平均(44.27±5.14)歲，其中<45歲38例，>45歲24例；腫瘤直徑為(12.56±5.45)mm；伴有和不伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者分別為21例和41例。所有病例進(jìn)行手術(shù)治療，均行甲狀腺癌手術(shù)切除，術(shù)后病理確診為PTC。切除的所有癌組織標(biāo)本立刻置于液氮中，在―80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫瑸镻TC組標(biāo)本；術(shù)中同時(shí)留取甲狀腺癌旁正常甲狀腺組織為癌旁對(duì)照組標(biāo)本。排除有甲狀腺手術(shù)史、哺乳期婦女、術(shù)前接受過(guò)放療或化療者、心肺肝腎嚴(yán)重疾病患者、其他惡性腫瘤者。兩組的一般資料如性別、年齡等具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽訂知情同意書(shū)。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)DOCK9-AS2mRNA表達(dá)Trizol試劑提取PTC組及癌旁對(duì)照組總RNA，用紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度和純度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。選取A260 nm/A280 nm在1.8～2.2的樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)SYBR Green說(shuō)明書(shū)，采用10 μL RT-PCR總反應(yīng)體系(SYBR Master Mix 5 μL、Primer1 0.2 μL、Primer2 0.2 μL、cDNA模板1 μL，加ddH2O至10 μL)；擴(kuò)增條件為95 ℃，持續(xù)3 min：95 ℃，變性5 s，60 ℃，退火30 s，循環(huán)次數(shù)為40。以GAPDH為內(nèi)參基因，基因引物序列為：DOCK9-AS2上游5′-CGCCCAAATACCCAGAGGTT-3′，下游5′-TTA-CGCTTCAGGCCAGTGTT-3′；GADPH上游5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游5′-GAA-GGCTGGGGCTCATTT-3′。計(jì)算2-△CT以判定mRNA相對(duì)表達(dá)。重復(fù)3次，取平均值。并分析PTC組織中DOCK9-AS2的表達(dá)變化與臨床病理的關(guān)系。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)人PTC癌細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))和正常甲狀腺細(xì)胞 (ATCC，美國(guó))，培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，1%青霉素-鏈霉素(南京碧云天公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))中，置于37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.4siRNA轉(zhuǎn)染按照說(shuō)明書(shū)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(Invitrogen公司，美國(guó))轉(zhuǎn)染DOCK9-AS2-NC和DOCK9-AS2-siRNAs(上海吉瑪公司)于PTC癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前12 h將細(xì)胞以3×105/孔接種于6孔板中。每孔轉(zhuǎn)染時(shí)，先將50 pmol DOCK9-AS2-siRNA與4 mol/L Lipo-fectamine 3000分別加至125 mol/L Opti-MEM (Gihco公司，美國(guó))中，5 min后輕輕混合，室溫孵育5 min后加到各個(gè)孔中，DOCK9-AS2-NC作為對(duì)照。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。DOCK9-AS2-Si的序列：正向5′-GCCCAAAUACCCAGAGGUUTT-3′，反向5′-AACCUCUGGGUA-UUUGGGCTT-3′；DOCK9-AS2-NC的序列：正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向5′-ACGUGACACGUUCGGAG AATT-3′。

1.5CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖變化將1.4項(xiàng)中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h時(shí)，消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板，在板周圍一圈的孔內(nèi)加入100 μL的PBS作為調(diào)零組，剩余孔板第2排到第7排的每排左側(cè)5孔分別加入100 μL的陰性對(duì)照組細(xì)胞懸液，右側(cè)5孔分別加入100 μL的DOCK9-AS2-siRNA組細(xì)胞懸液，共有6排細(xì)胞，即6組細(xì)胞。從種板第2天開(kāi)始，待細(xì)胞貼壁后每天取1組細(xì)胞(即96孔板第2排到第7排，共有6組)，每孔加入5 mg/mL的CCK-8 20 μL。常規(guī)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度，連續(xù)檢測(cè)5 d，重復(fù)3次。

1.6劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定BCPAP細(xì)胞的遷移能力取出1.4項(xiàng)中轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，取出1.4中轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，用200 μL的無(wú)菌移液槍頭在6孔板底部呈“一”字型劃痕(作為0 h)，再于培養(yǎng)板底用標(biāo)簽筆在培養(yǎng)板底隨機(jī)標(biāo)記5個(gè)觀察點(diǎn)；加入PBS沖洗后，加入新鮮不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，采用Quantity One軟件對(duì)劃痕面積進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1PTC組織中DOCK9-AS2的表達(dá)上調(diào)PTC組、癌旁對(duì)照組的DOCK9-AS2的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.009 7±0.004 4、0.002 6±0.001 0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織中DOCK9-AS2mRNA的表達(dá)

Fig.1 mRNA expression of DOCK9-AS2 in PTC tissues and adjacent tissues

T：甲狀腺乳頭狀癌組織；N：甲狀腺癌旁組織。

2.2PTC組織中DOCK9-AS2的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，PTC癌組織中DOCK9-AS2的表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腺外侵犯有關(guān)(P<0.05)，與其他病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

2.3BCPAP細(xì)胞株增殖與遷移情況通過(guò)siRNAs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞BCPAP，48 h進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示，干擾組DOCK9-AS2表達(dá)明顯下降(圖2A)；CCK8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于陰性對(duì)照組，干擾組細(xì)胞活力顯著減弱(圖2B)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾DOCK9-AS2后，BCPAP細(xì)胞的遷移能力顯著下降(圖3)。

表1DOCK9-AS2的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Correlation between DOCK9-AS2 expression and clinicopathological characteristics of PTC patients

病理特征n低表達(dá)高表達(dá)P性別 男211110 女4123180.865年齡(歲) ≤45432518 >45199100.633多灶性 是1679 否4627190.534微小癌 是22139 否4021190.757腺外侵犯 是18216 否4432120.010淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是32725 否30273<0.001

圖2RT-PCR檢測(cè)si-RNA轉(zhuǎn)染后BCPAP細(xì)胞中DOCK9-AS2的表達(dá)及CCK-8檢測(cè)BCPAP細(xì)胞增殖變化

Fig.2 DOCK9-AS2 mRNA expression of BCPAP cells after transinfected si-RNA detected by RT-PCR and BCPAP cell proliferation ability detected by CCK-8

圖3劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定BCPAP細(xì)胞的遷移情況(A)和比較(B)

Fig.3 The migration of BCPAP cells (A) detected by wound healing assay and the comparison (B)

3 討 論

近年來(lái)，甲狀腺癌發(fā)病率逐年遞增，并且呈年輕化趨勢(shì)[6]。淋巴結(jié)是甲狀腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移最主要的器官，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為5%～20%[7-8]。PTC是最常見(jiàn)的甲狀腺癌類型。根據(jù)研究報(bào)道，30%～70%的PTC患者會(huì)出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且其預(yù)后相對(duì)較差[9-11]。然而，在臨床實(shí)踐中，對(duì)PTC的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶及復(fù)發(fā)灶進(jìn)行檢測(cè)主要采用的細(xì)針穿剌術(shù)，其穿刺報(bào)告中顯示為“不確定性”的有三成左右[12]。而其他常用方法如超聲、CT、FDG-PET/CT等，不僅費(fèi)用昂貴，而且精確度不高[13-14]。由于目前分子標(biāo)記物已被廣泛用于多種疾病的臨床診斷和預(yù)后判斷過(guò)程[15]。因此，本研究探索了長(zhǎng)鏈非編碼RNA DOCK9-AS2是否與PTC的增殖轉(zhuǎn)移有關(guān)。

人們過(guò)去一直認(rèn)為，在哺乳動(dòng)物基因組當(dāng)中，超過(guò)90%的基因無(wú)編碼功能，這些基因是沒(méi)有作用的。但是隨著人類基因組計(jì)劃的完成，這些非編碼RNA被證實(shí)在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[4]。相關(guān)研究表明，哺乳動(dòng)物中有90%的非編碼 RNAs(ncRNA)，它們不作為翻譯的模板，編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)。ncRNA有2種類型，即lncRNA和miRNA，其異常表達(dá)往往對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用[16]。DOCK9基因位于染色體13q32，編碼230 ku的DOCK9蛋白。DOCK9蛋白屬于DOCK-D家族成員之一，具有GTP/GDP交換因子活性，能夠特異性地激活G蛋白CDC42，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。DOCK9-AS2是DOCK9反義非編碼RNA，同樣在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。但目前相關(guān)的研究很少，僅有1篇報(bào)道證明其與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后有關(guān)[17]。

本研究分析62例PTC的臨床組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，DOCK9-AS2在PTC中高表達(dá)。根據(jù)臨床病理參數(shù)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DOCK9-AS2的表達(dá)僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腺外侵犯有關(guān)。CCK-8和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DOCK9-AS2高表達(dá)對(duì)PTC中BCPAP細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程起明顯的促進(jìn)作用。以上結(jié)果提示，DOCK9-AS2對(duì)PTC具有促癌作用，并為其提供了有效的理論依據(jù)。

綜上所述，lncRNA DOCK9-AS2或許能成為PTC治療和預(yù)后判斷的新靶點(diǎn)，但其分子水平上的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探索與證實(shí)。