馬 瓊，段靜嫻，王 燕，孫素姣，陳麗華

(大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)美容學(xué)教研室，云南 大理 671000)

因糖皮質(zhì)激素外用制劑及含激素類(lèi)化妝品的濫用，臨床上糖皮質(zhì)激素依賴性皮炎(下稱激素依賴性皮炎，corticosteroid addictive dermatitis，CAD)的發(fā)病率日益增多。以往的治療方法僅僅能在一定程度上緩解患者的主觀癥狀或客觀癥狀[1-2]，本研究采用低能量810 nm半導(dǎo)體激光治療激素依賴性皮炎，探索一種新的既能緩解患者的主觀癥狀，又能改善患者客觀癥狀的安全有效的方法?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象：選擇健康雄性豚鼠40只(大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，滇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證第2016102號(hào))，體重(200±50)g，隨機(jī)分為兩組，分別為模型組30只及空白對(duì)照組10只。分組飼養(yǎng)：對(duì)照組10只一籠、模型組30只分為10只、10只、10只三籠飼養(yǎng)。喂食標(biāo)準(zhǔn)兔飼料(大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，并定期補(bǔ)充Vit C預(yù)防足部潰瘍。所有動(dòng)物自由攝食、攝水。

1.2制作激素依賴性皮炎豚鼠模型：參考潘煒華等[3]的豚鼠激素依賴性皮炎的動(dòng)物模型制作方法，兩組實(shí)驗(yàn)豚鼠采用自身對(duì)照法，以背部中線為界，所有實(shí)驗(yàn)豚鼠用市售脫毛膏脫去約6 cm×6 cm皮膚作為實(shí)驗(yàn)區(qū)，對(duì)照組左右兩側(cè)皮膚、模型組左側(cè)皮膚為對(duì)照區(qū)，模型組豚鼠右側(cè)皮膚脫毛后涂擦0.05%氯倍他索乳膏(昆明滇紅藥業(yè)有限公司)，2次/d，共涂藥60 d制造激素依賴性皮炎皮膚模型。

1.3810 nm半導(dǎo)體激光照射：造模成功后1周，將模型組豚鼠隨機(jī)分為模型組10只、試驗(yàn)A組10只、試驗(yàn)B組10只。每次激光照射前試驗(yàn)組豚鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行脫毛并固定體位拍照。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試光斑，確定激光的照射參數(shù)為：雙脈沖，能量密度8 J/cm2，脈寬為3 ms，脈沖延時(shí)為150 ms，治療頻率1 Hz，光斑直徑12 mm，冷卻頭16 mm×20 mm，每個(gè)部位可重復(fù)照射兩次。激光照射前先由兩名實(shí)驗(yàn)人員固定豚鼠的四肢及頭部，充分暴露照光區(qū)皮膚，在治療區(qū)皮膚表面均勻的涂敷醫(yī)用冷凝膠，厚度大約為1 mm，然后使用上述參數(shù)做光斑測(cè)試。先觀察測(cè)試光斑的反應(yīng)，治療時(shí)將治療頭垂直輕壓在凝膠上，對(duì)準(zhǔn)皮膚，然后逐漸平行移動(dòng)治療頭開(kāi)始激光照射。試驗(yàn)A組和試驗(yàn)B組豚鼠采用相同的治療參數(shù)照射右側(cè)皮損區(qū)皮膚，試驗(yàn)A組每周照射1次，試驗(yàn)B組 2周照射1次，共進(jìn)行三次激光照射。

1.4取材：分別于造模成功后一周模型組豚鼠(10只)切取皮膚樣本，固定液固定；試驗(yàn)組A豚鼠(10只)于激光照射結(jié)束后一周切取皮膚樣本，固定液固定；試驗(yàn)B組(10只)及對(duì)照組(10只)于激光照射結(jié)束后一周切取皮膚樣本，固定液固定。取材方法：脫毛后由實(shí)驗(yàn)人員固定豚鼠以相對(duì)固定的體位拍照，5 ml無(wú)菌注射器抽取4%水合氯醛(大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室配制)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，先用75%乙醇消毒背部皮膚，迅速用眼科剪剪取模型組、對(duì)照組、試驗(yàn)A組及試驗(yàn)B組激光照射區(qū)皮膚，大小為1×1 cm2，將皮膚樣本組織用生理鹽水沖洗表面積血后放入20 ml容器中，4%多聚甲醛固定并封口，并用記號(hào)筆標(biāo)記分組及取材時(shí)間。固定的標(biāo)本用石蠟包埋、切片，HE染色。

1.5結(jié)果判定

1.5.1表皮、真皮厚度測(cè)定：空白對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組四組切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下放大倍數(shù)為100倍及400倍，測(cè)量每個(gè)視野表皮、真皮的厚度，取其厚度的平均值作為表皮、真皮的厚度，單位為μm。

1.5.2炎性細(xì)胞數(shù)量的變化：空白對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組四組切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下放大倍數(shù)為100倍及400倍，計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化。

2 結(jié)果

2.1肉眼大體觀察情況結(jié)果：見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)組A、試驗(yàn)組B豚鼠皮膚外觀：①對(duì)照組，皮膚平整飽滿，無(wú)明顯紅斑、腫脹；②模型組，皮膚出現(xiàn)明顯的紅斑、腫脹、皺紋；③試驗(yàn)A組，皮膚飽滿、紅斑消退，皺紋減少；④試驗(yàn)組B，皮膚飽滿、紅斑消退，皺紋減少

2.2HE染色結(jié)果：對(duì)照組表皮層細(xì)胞排列整齊，真皮層膠原纖維排列整齊、致密，染色均一(見(jiàn)圖2中①②)。模型組表皮變薄，細(xì)胞層數(shù)減少，排列紊亂，角質(zhì)層上皮細(xì)胞角化不全；顆粒層變薄，見(jiàn)細(xì)胞變性、壞死，部分胞核碎裂，棘突變平。真皮層可見(jiàn)真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張、數(shù)量增加，真皮血管周?chē)梢?jiàn)較多的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；真皮層膠原纖維數(shù)量減少，纖維排列紊亂、疏松(見(jiàn)圖2中③④)。試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組與模型組相比表皮細(xì)胞層數(shù)增加，表皮增厚；真皮乳頭層見(jiàn)較多的成纖維細(xì)胞，真皮網(wǎng)狀層與模型組相比，膠原纖維數(shù)量增加，排列整齊、致密，染色增強(qiáng)，真皮層明顯變厚(見(jiàn)圖2中⑤～⑧)。模型組與對(duì)照組比較，真皮淺層淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，試驗(yàn)A組、試驗(yàn)B組與模型組比較，真皮淺層淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，中性粒細(xì)胞數(shù)量減少(見(jiàn)圖2中⑥、⑧)。

圖2 對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)組A、試驗(yàn)組B豚鼠皮膚HE染色

組別例數(shù)表皮厚度(μm)真皮厚度(μm)淋巴細(xì)胞(/HP)中性粒細(xì)胞(/HP)對(duì)照組1027.60±1.09156.88±7.365.00±5.556.00±5.79模型組1020.87±1.11102.79±6.5445.00±7.4347.00±6.37試驗(yàn)A組1024.37±1.15130.68±7.5113.00±7.5214.00±7.15試驗(yàn)B組1025.12±1.37146.54±6.7926.00±6.5727.00±6.45

注：以上結(jié)果均在高倍×400下測(cè)得

3 討論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)如果皮膚局部長(zhǎng)期使用強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素超過(guò)6周，就能導(dǎo)致皮膚表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞體積縮小，角質(zhì)層的細(xì)胞層數(shù)減少，鏡下只有2～3層細(xì)胞，而且細(xì)胞的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了異常；此外角質(zhì)層透明層顆粒層細(xì)胞形成減少，最終使角質(zhì)層變薄，甚至缺失[3]。從表1中可以看出，模型組豚鼠在使用強(qiáng)效激素60 d后，表皮層細(xì)胞層數(shù)較對(duì)照組減少，厚度變??；真皮層成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維數(shù)量減少，排列紊亂，真皮厚度較對(duì)照組變薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

810 nm激光屬于遠(yuǎn)紅外光，使用多脈沖(雙脈沖)、長(zhǎng)脈寬(150 ms)、低強(qiáng)度功率(10 J/cm2)激光作用于人體可產(chǎn)生一系列生物刺激效應(yīng)：波長(zhǎng)>630 nm的紅光，其穿透組織的深度較深，能夠直接作用于皮膚的真皮層。Grossman等使用波長(zhǎng)780 nm、能量密度為0.5 J/cm2的激光照射試管內(nèi)的成纖維細(xì)胞，證實(shí)其能夠顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[4]；馬長(zhǎng)升等應(yīng)用650 nm低能量半導(dǎo)體激光照射家兔皮膚傷口，也證實(shí)該波長(zhǎng)的低能量激光刺激能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖而促進(jìn)傷口的愈合[5]。以上都為本研究選擇810 nm半導(dǎo)體激光治療激素依賴性皮炎導(dǎo)致的皮膚萎縮提供了理論依據(jù)。

表1中，模型組豚鼠表皮在強(qiáng)效激素0.05%的氯倍他索作用下表皮細(xì)胞層數(shù)減少、變薄，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。810 nm半導(dǎo)體激光照射后，試驗(yàn)組A豚鼠的表皮細(xì)胞層數(shù)增加，厚度增厚，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；試驗(yàn)組B豚鼠的表皮細(xì)胞層數(shù)增加，厚度增厚，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但試驗(yàn)組A與試驗(yàn)組B比較，表皮增厚程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表1中模型組豚鼠真皮在藥物作用下真皮層成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原纖維數(shù)量減少，排列紊亂，導(dǎo)致真皮厚度變薄，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。810 nm半導(dǎo)體激光照射后，試驗(yàn)組A真皮層見(jiàn)較多的成纖維細(xì)胞，與模型組相比膠原纖維數(shù)量增多，排列整齊、致密，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)B組真皮層見(jiàn)較多的成纖維細(xì)胞，與模型組相比膠原纖維數(shù)量增多，排列整齊、致密，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)B組與試驗(yàn)A組比較，真皮增厚更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，低能量810 nm半導(dǎo)體激光照射激素依賴性皮炎豚鼠模型皮膚后，均能使其表皮厚度增加，但治療間隔時(shí)間對(duì)其影響不大；低能量810 nm半導(dǎo)體激光治療也均能使豚鼠模型皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞增多，膠原纖維數(shù)量增多，排列更加致密和整齊，但試驗(yàn)組B治療間隔時(shí)間為兩周，較試驗(yàn)組A治療間隔時(shí)間為一周真皮厚度增加更為明顯，說(shuō)明激光治療對(duì)真皮的膠原纖維作用時(shí)效性可以一直延續(xù)，而且低能量的激光照射可產(chǎn)生良性的生物刺激，可見(jiàn)810 nm半導(dǎo)體激光在對(duì)激素依賴性皮炎導(dǎo)致的皮膚萎縮的治療過(guò)程中治療間隔為兩周更為適宜。

Yano等、米新賓等在研究中發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度激光并沒(méi)有直接殺滅細(xì)菌的作用，但其可通過(guò)增加淋巴因子和溶菌酶的活性刺激吞噬細(xì)胞，抑制粒細(xì)胞的功能，從而起到抑制細(xì)菌作用，而且低強(qiáng)度激光的抑菌作用主要還和激光照射的強(qiáng)度、照射的時(shí)間和照射的次數(shù)有直接的關(guān)系[6-7]。當(dāng)激光照射達(dá)到一定數(shù)值的能量密度時(shí)，就能夠起到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。所以使用低強(qiáng)度激光照射在臨床上治療炎性疾病并不是通過(guò)直接殺滅細(xì)菌來(lái)達(dá)到治療目的，而是通過(guò)低強(qiáng)度激光的光化學(xué)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)炎癥性疾病的治療。Yano等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明低強(qiáng)度激光一方面能直接抑制部分細(xì)菌的生長(zhǎng)[6]；另一方面通過(guò)低強(qiáng)度激光照射可提高溶菌酶和溶酶體酸性磷酸酶活性，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高特異性和非特異性免疫的作用[8]。

表1中，模型組豚鼠與對(duì)照組相比，相同視野下，模型組炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明長(zhǎng)期使用激素或含激素類(lèi)藥物或化妝品均能使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量增加，從而導(dǎo)致皮膚產(chǎn)生炎性反應(yīng)，使患者在臨床上出現(xiàn)瘙癢、紅腫、腫脹等癥狀。模型組A及模型組B在經(jīng)過(guò)低強(qiáng)度激光照射后，相同視野下，真皮層中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)上述低強(qiáng)度激光對(duì)于皮膚炎性反應(yīng)的治療機(jī)制，說(shuō)明低能量810 nm半導(dǎo)體激光對(duì)于激素依賴性皮炎所引起的炎細(xì)胞浸潤(rùn)能夠起到一定的治療作用。表1中，試驗(yàn)A組與試驗(yàn)B組相比較，試驗(yàn)A組炎性細(xì)胞數(shù)量的減少較試驗(yàn)B組更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明在激素依賴性皮炎的炎性反應(yīng)急性期，縮短兩次激光治療的間隔時(shí)間(即一周激光照射一次)更能明顯減輕炎性反應(yīng)?？梢?jiàn)810nm半導(dǎo)體激光在對(duì)激素依賴性皮炎導(dǎo)致的急性期炎性反應(yīng)的治療過(guò)程中，治療間隔時(shí)間為一周更為適宜。

低能量810 nm半導(dǎo)體激光可刺激豚鼠激素依賴性皮炎表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，使角質(zhì)形成細(xì)胞的層數(shù)增加，表皮層增厚，并可促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞數(shù)量的增加，使膠原纖維數(shù)量增加，使真皮層增厚，對(duì)于激素依賴性皮炎所導(dǎo)致的皮膚菲薄萎縮及皮膚屏障的修復(fù)治療間隔周期為兩周更為適宜。低能量810 nm半導(dǎo)體激光可減少豚鼠激素依賴性皮炎炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量，且在皮炎的急性期重復(fù)治療間隔周期設(shè)定為一周更為適宜。