方杰 呂哲 劉嘉音 王琛 洪甘濟 鄭良城 馬琪林

帕金森病(Parkinson disease, PD)是僅次于阿爾茲海默病的世界第二大退行性疾?。?］。其主要病理特點為黑質(zhì)紋狀體多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元選擇性、漸進性的變性缺失, 膠質(zhì)細(xì)胞增生和細(xì)胞胞內(nèi)路易氏小體(Lewy body)形成［2］。病因機制仍不完全清楚, 其中免疫炎癥機制在其發(fā)病過程中起著重要的作用［3］。CD4++Th淋巴細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞參與了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展［4］, 在PD模型中,N-α-synuclein可刺激Th17相關(guān)基因的高表達, 誘導(dǎo)Th17分化, 促進炎癥級聯(lián)反應(yīng), 從而介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的損傷［5］。本研究應(yīng)用MPTP小鼠模型, 研究Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和特異性炎癥因子IL-17對PD的作用, 進一步明確Th17在PD中的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇14～15周齡、雄性、體重(27±2)g的C57BL/6小鼠, 常規(guī)飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 PD模型構(gòu)建 將48只C57BL/6小鼠隨機分為PD模型組和對照組, 每組24只。PD模型組：造模第1天按照MPTP 20 mg/(kg·次), 每次間隔2 h, 腹腔注射4次。對照組：同樣的方法按照0.05 ml/次注射生理鹽水。兩組小鼠均在造模第2天開始, 連續(xù)腹腔注射生理鹽水7 d, 0.2 ml/(次·d)。

1.2.2 行為學(xué)檢測 小鼠行為學(xué)檢測轉(zhuǎn)棒儀速度設(shè)置為5 min內(nèi)從4 r/min逐漸增加到40 r/min, 每次檢測間隔5 min,連續(xù)測3次取平均值。

1.2.3 中腦黑質(zhì)TH免疫化學(xué)染色 實驗小鼠進行行為學(xué)檢測后, 每組各取小鼠6只進行取材。取出中腦常規(guī)處理后以12 μm冠狀位連續(xù)冰凍切片, 室溫封閉30 min, 1∶200比例稀釋的抗TH兔多克隆抗體覆蓋, 孵育48 h。再次洗滌后將1∶200比例稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體滴入切片上, 孵育6 h。洗滌后封片, 后將片子熒光正置顯微鏡下觀察, 計數(shù)每只小鼠10張切片的TH陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 法檢測外周血IL-17的表達 行為學(xué)實驗后的小鼠每組取6只常規(guī)處理后進行眼球取血制備血清樣本。復(fù)孔加入100 μl梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品, 樣本孔加入20 μl的樣本和80 μl的1×檢測緩沖液, 并在每孔中加入50 μl稀釋后的檢測抗體, 室溫下孵育1.5 h。洗滌后每個微孔中加入100 μl稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素, 孵育30 min。再次洗滌后每孔加入100 μl的底色顯物TMB, 室溫下避光反應(yīng)20 min, 測定樣本光密度(OD)值, 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中檢測因子的含量。

1.2.5 Real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法檢測中腦黑質(zhì)中RORγt和IL-17的mRNA表達水平 行為學(xué)實驗后每組取6只小鼠常規(guī)處理取中腦黑質(zhì)組織, Trizol提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, Primer 5設(shè)計引物, PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性30 s, 95℃變性5 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸20 s,40個循環(huán)。記錄內(nèi)參基因與目的基因的Ct值, 運用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 Western blot法檢測中腦黑質(zhì)中RORγt和IL-17的蛋白表達水平 行為學(xué)實驗后的小鼠每組取6只常規(guī)處理取中腦黑質(zhì)組織制備樣本, 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)過后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用TBS/T洗膜液清洗,封閉2 h后加入一抗溶液, 4℃包被過夜。洗滌后加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液, 室溫孵育1 h。再次洗滌后的PVDF膜用增強型化學(xué)發(fā)光劑溶液浸潤, 于全自動化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 5軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示, 采用獨立樣本t檢驗和單因素方差檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測及免疫熒光染色 PD模型表現(xiàn)出肢體震顫、尾部僵直、運動減少等異常行為學(xué)反應(yīng), PD模型組轉(zhuǎn)棒時間為(17.6±2.3)s顯著短于對照組的(112.1±8.6)s, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。PD模型組中腦TH陽性反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)目較對照組明顯減少。見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)棒行為學(xué)實驗兩組小鼠轉(zhuǎn)棒時間

圖2 兩組小鼠中腦TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元免疫熒光染色圖

2.2 IL-17和RORγt的表達水平 PD模型組外周血IL-17表達為(32.58±6.21)高于對照組的(7.46±2.10), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。PD模型組中腦黑質(zhì)中RORγt和IL-17的mRNA表達水平分別為(8.87±1.12)、(5.66±0.85)高于對照組的(2.64±0.52)、(2.08±0.41), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖 4, 圖 5。

圖3 兩組小鼠外周血IL-17表達水平

圖4 兩組小鼠中腦黑質(zhì)中IL-17和RORγt的mRNA表達水平

圖5 兩組小鼠中腦黑質(zhì)中IL-17和RORγt的蛋白表達水平的免疫印跡圖

3 討論

免疫炎癥是PD的重要病理機制［3］, 抗炎藥物降低罹患PD的風(fēng)險提示了進一步研究炎癥機制及尋找可能的治療靶點具有重要意義［6］。本實驗中觀察到PD模型出現(xiàn)軀體僵直、震顫、豎毛、運動減少等行為異常表現(xiàn)。轉(zhuǎn)棒儀檢測顯示PD模型組轉(zhuǎn)棒時間顯著短于對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中腦組織TH特異性染色顯示PD模型組中腦DA能神經(jīng)元顯著少于對照組。這些表明MPTP可誘導(dǎo)PD樣病理損害［7］。

淋巴細(xì)胞可穿過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8］, 在PD病程中, CD4++T細(xì)胞在神經(jīng)毒性損傷機制中發(fā)揮著重要作用［9］。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的CD4++T細(xì)胞, 有研究表明Th17是介導(dǎo)MPTP模型小鼠DA能神經(jīng)元損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞［5］。本研究顯示PD模型外周血中IL-17顯著高表達, 證明系統(tǒng)性免疫炎癥反應(yīng)可能參與其致病機制。PD模型的中腦黑質(zhì)中RORγt和IL-17在基因和蛋白水平一致性表達上調(diào), 表明Th17細(xì)胞及其炎癥因子可能參與了PD的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷過程。結(jié)合既往研究結(jié)果, 推測Th17引起的系統(tǒng)性免疫炎癥反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)可能協(xié)同促進了PD的病理損害。

綜上所述, Th17細(xì)胞及其炎癥因子可能通過誘發(fā)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)參與PD的發(fā)生及發(fā)展, 進一步深入研究其具體作用和效應(yīng)機制, 為探索PD免疫治療新方法奠定基礎(chǔ)。