胡熙耀，張玉芳，萬(wàn) 超，陳德森

鹿瓜多肽從干燥成熟甜瓜種子和梅花鹿骨骼中提取，是一類(lèi)富含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白的多肽類(lèi)滅菌水溶液。其骨形態(tài)發(fā)生蛋白可調(diào)節(jié)骨鈣磷代謝，增加骨鈣沉積，并通過(guò)刺激成骨細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)新骨和骨痂形成，使骨折得以修復(fù)和愈合[1-2]。其中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子還具有降低骨折局部毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)骨折椎體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，減少骨折局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，起到抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕等作用[3-4]。鹿瓜多肽可提骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折動(dòng)物模型的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和二聚糖的含量，對(duì)促進(jìn)骨折的愈合起到?jīng)Q定作用[5]。VEGF可促進(jìn)骨折局部血管新生，增加骨折局部血供、促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合[6]。臨床上鹿瓜多肽主要用于骨折、骨質(zhì)疏松等疾病的輔助治療，由于其治療骨折、骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)較少，對(duì)于治療機(jī)制鮮有分析，本研究設(shè)計(jì)了新西蘭兔L1–L5節(jié)段椎體壓縮性骨折動(dòng)物模型，采用穴位注射骨折部位肌肉的方法，觀察注射用鹿瓜多肽對(duì)該模型動(dòng)物VEGF及椎間盤(pán)二聚糖的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康新西蘭兔48只，兔齡6～7個(gè)月，體質(zhì)量1.8～2.2 kg。采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)隨機(jī)分隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、鹿瓜多肽小劑量組、鹿瓜多肽大劑量組，每組8只。動(dòng)物房濕度50%～75%，溫度18～25 ℃。

1.2 試劑及藥品 注射用鹿瓜多肽（黑龍江迪龍制藥有限公司，批號(hào)20160721）；兔抗鼠VEGF抗體（上海心語(yǔ)生物科技有限公司，批號(hào)160703）。

1.3 兔L1–L5節(jié)段椎體骨折動(dòng)物模型制備 10%水合氯醛（0.35 g/kg）注射兔腹腔麻醉。腹部向下固定，紗布蘸取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的硫化鈉涂于相當(dāng)于椎體L1–L5水平皮膚，退掉術(shù)區(qū)兔毛。碘伏消毒，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇脫碘，鋪無(wú)菌巾?？v行切開(kāi)兔L1–L5節(jié)段椎體皮膚，暴露兔腹膜后間隙，鈍性分離兔L1–L5節(jié)段背闊肌、背最長(zhǎng)肌、棘間肌、韌帶，分離暴露L1–L5節(jié)段的椎間盤(pán)。鋼絲剪小心從椎體側(cè)前方剪斷L1–L5節(jié)段椎體前緣，椎體不做內(nèi)固定。分層縫合，再次消毒，乙醇脫碘。術(shù)后肌肉注射4萬(wàn)單位慶大霉素，1次/d，注射7 d。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，每日強(qiáng)迫動(dòng)物活動(dòng)6 h，利用動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和重身重量壓縮造成椎體骨折?？瞻讓?duì)照組僅腹腔注射10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉及手術(shù)區(qū)剃毛。

成模依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)[7]：兔具有發(fā)達(dá)的腹側(cè)肌群及脊柱背側(cè)肌群等生物學(xué)特性，在術(shù)后不做內(nèi)固定也不會(huì)出現(xiàn)明顯骨折斷端移位現(xiàn)象。兔清醒站立時(shí)因脊柱負(fù)重，L1–L5節(jié)段骨折椎體處于擠壓的狀態(tài)，其被剪斷的L1–L5節(jié)段椎體斷端骨小梁會(huì)相互擠壓、嵌插、扭曲，導(dǎo)致L1–L5節(jié)段椎體變短，在2周內(nèi)就會(huì)因?yàn)樽陨碇亓蛷?qiáng)迫運(yùn)動(dòng)等因素的作用下壓縮變短。造模14 d時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行拍攝CR分析造模效果，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)明顯的椎體壓縮變短病理改變，說(shuō)明建模成功，模型成功率為100%。

1.4 治療方法 椎體壓縮骨折術(shù)后14 d傷口愈合，尊循循經(jīng)選穴的原則，選L1–L5脊柱兩側(cè)夾脊穴，配合血海、足三里、陽(yáng)陵泉穴位注射鹿瓜多肽，治療14 d。小劑量組穴位注射鹿瓜多肽3 mL?kg-1?d-1，鹿瓜多肽大劑量組 6 mL?kg-1?d-1，連續(xù)治療21 d?？瞻讓?duì)照組及模型組注射等量生理鹽水作為對(duì)照。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 于治療前后分別處死6只動(dòng)物，取兔L1–L5節(jié)段骨折椎體（骨痂組織），中性甲醛固定，銷(xiāo)酸脫鈣4～5 h，石蠟包埋。VEGF采用免疫組化染色法（SP法）檢測(cè)，DAB顯色，脫水透明封片，陽(yáng)性結(jié)果判定以胞漿內(nèi)棕色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，以棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原的定位，隨機(jī)選取5個(gè)視野，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)百分率表示VEGF陽(yáng)性表達(dá)率。另取骨痂組織標(biāo)本于液氮冷凍，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)。檢測(cè)時(shí)將上述標(biāo)本置無(wú)菌研缽研碎，脫鈣后組織勻漿，移入離心管，3000 r/min離心。PCR擴(kuò)增引物序列用P fi mer5軟件設(shè)計(jì)，檢測(cè)時(shí)先用RNA抽提試劑盒提取勻漿液中總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；配制PCR的總反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增后RT-PCR分析VEGF mRNAR表達(dá)水平。VEGF上游引物：5’-ACAGGCATCGCCTACGCTAC-3’，下游引物：5’-GCATCCTCTAGCTGACGCACG-3’。內(nèi)參上游引物：5’-ACTACCTGGATACCATCGACTAC-3’，下游引物：5’-CTAACCCTAGCGGATGGTC-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃、52℃、72℃各30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。使用Curve Expert 1.3軟件繪制上述樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以目的基因灰度值/β-actin灰度值表示VEGF mRNAR的表達(dá)值，讀取VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用免疫熒光法測(cè)定兔腰椎間盤(pán)組織二聚糖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件 ,本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，以± s 表示，對(duì)于組間的均數(shù)檢驗(yàn)和組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、VEGF mRNA表達(dá)測(cè)定 空白對(duì)照組兔L1–L5節(jié)段椎體骨折椎體VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量較少，治療前后無(wú)明顯變化。與空白對(duì)照組比較，模型組在L1–L5節(jié)段骨折椎體VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高（P＜0.05）。經(jīng)21 d治療，與模型組比較,鹿瓜多肽鹿瓜多肽小/大劑量VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高（P＜0.05），但鹿瓜多肽小/大劑量?jī)山M組間比較無(wú)差異（P＞0.05）。如表1和圖1。經(jīng) RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，模型組在L1–L5節(jié)段骨折椎體VEGF mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與VEGF陽(yáng)性表達(dá)率一致。經(jīng)21 d治療，與模型組比較，鹿瓜多肽鹿瓜多肽小/大劑量VEGF mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），但鹿瓜多肽小/大劑量?jī)山M組間比較無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2和圖3。

2.2 二聚糖光密度及骨密度比較 空白對(duì)照組L1–L5節(jié)段椎間盤(pán)二聚糖光密度及骨密度治療前后保持在較高水平，且治療前后無(wú)明顯變化（P＞0.05）；模型組二聚糖光密度及骨密度在治療前后均明顯降低，與空白對(duì)照組比較有差異（P＜0.05）。鹿瓜多肽小/大劑量治療21 d后，二聚糖光密度及骨密度顯著升高，與模型組比較有差異（P＜0.05）；鹿瓜多肽小/大劑量?jī)山M間比較無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

表1 兔L1–L5節(jié)段骨折椎體VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及VEGF mRNA/β-actin灰度值比值比較（n=6， ）

圖1 4組大鼠VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較

圖3 4組大鼠VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2 4組大鼠VEGF mRNA電泳圖

2.3 治療后X線比較 在治療的21 d時(shí)，模型組兔L1節(jié)段椎體骨折椎體明顯變短增粗，骨折處椎體骨密度較鄰近椎體高，有帶狀致密陰影或低密度線，骨折椎體未愈合（見(jiàn)圖1）。鹿瓜多肽小/大劑量組骨折處椎體骨密度接近或高于相鄰椎體，有少量斑片狀陰影，骨折椎體較相鄰短、略粗，骨折椎體基本愈合（見(jiàn)圖1-圖3）。

表2 二聚糖光密度及骨密度比較（n=6， ）

圖1 模型組

圖2 鹿瓜多肽小劑量組

圖3 鹿瓜多肽大劑量組

3 討論

L1–L5節(jié)段椎體骨折較為常見(jiàn)，以50歲以上的絕經(jīng)老年婦女為多。脊柱椎體骨折的主要原因體內(nèi)鈣流失過(guò)多，骨質(zhì)疏松較為嚴(yán)重,其椎間盤(pán)組織中二聚糖異常降低。脊柱椎體終板損傷可引起椎間盤(pán)退行性變，骨質(zhì)疏松是造成脊柱壓縮性骨折重要病因，椎間盤(pán)病理檢查常出現(xiàn)二聚糖、水分及蛋白多糖含量減少的現(xiàn)象[8]。正常情況下，二聚糖通過(guò)抑制炎性因子白介素-l的合成，激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白通路來(lái)參與調(diào)節(jié)椎間盤(pán)新陳代謝，達(dá)到抑制椎間盤(pán)退行性的目的[9]。而VEGF作為促血管生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移及再生、參與骨折部位動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)，在骨折的愈合過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[10]。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取的穴位以經(jīng)穴體系為理論依據(jù)，有關(guān)腧穴采用鹿瓜多肽穴位注射。這種治療方法是以經(jīng)絡(luò)為載體，使針、藥、穴的綜合作用于骨折處所支配的神經(jīng)，明顯提高藥物吸收和藥物治療作用[11]。實(shí)驗(yàn)中所選用的“夾脊穴、血海、足三里、陽(yáng)陵泉”等諸穴均為經(jīng)典的治療椎間盤(pán)退行性腧穴，刺激后可起到疏風(fēng)通絡(luò)、行氣止痛之功效[12]。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組比較,鹿瓜多肽小/大劑量組在治療21 d后，其VEGF、VEGF mRNA、二聚糖及骨密度均明顯升高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，穴位注射鹿瓜多肽可促進(jìn)兔L1–L5節(jié)段椎體損傷時(shí)VEGF分秘及VEGF mRNA表達(dá)。本研究認(rèn)為，VEGF及VEGF mRNA參與了椎體損傷后的修復(fù)，在這個(gè)過(guò)程中，鹿瓜多肽可能刺激了VEGF分泌，促進(jìn)骨折血管的新生，增加損傷局部的血供，有利于骨折愈合。有報(bào)導(dǎo)，鹿瓜多肽可誘導(dǎo)骨折愈合過(guò)程中VEGF分泌及VEGF mRNA表達(dá)[13-14]，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象高度一致。另一方面，鹿瓜多肽小/大劑量組兔L1–L5節(jié)段椎間盤(pán)組織中二聚糖及骨密度均明顯升高，這是由于注射用鹿瓜多肽具有多種生物活性，其骨誘導(dǎo)多肽類(lèi)生物因子促進(jìn)了機(jī)體內(nèi)影響骨形成和吸收的骨源性生長(zhǎng)因子的合成，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，這些成分可促進(jìn)骨折部位細(xì)胞有絲分裂、分化及趨化作用[15]。研究表明，BMP參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)、增強(qiáng)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，增加骨鈣素的合成、促進(jìn)新骨及骨痂形成[16]。注射用鹿瓜多肽可增加骨鈣沉積，故鹿瓜多肽小/大劑量組兔L1–L5節(jié)段動(dòng)物椎體骨密度高于模型組。另外，注射用鹿瓜多肽中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能降低骨折局部毛細(xì)血管通透性，抑制機(jī)體前列腺素E2的合成與釋放，減輕炎性浸潤(rùn)而達(dá)到止痛作用[17]。有研究表明，在促進(jìn)骨折早期愈合過(guò)程中，注射用鹿瓜多肽中的骨誘導(dǎo)多肽生物因子還可促進(jìn)骨原性生長(zhǎng)因子的合成，調(diào)節(jié)鈣磷代謝、增加骨鈣沉積而提高骨密度[18]。

注射用鹿瓜多肽治療椎體骨折的機(jī)制可能為，穴位注射可促進(jìn)兔L1–L5節(jié)段椎體骨折愈合過(guò)程中VEGF的合成分泌，促使骨折椎體血管內(nèi)皮新生，調(diào)節(jié)椎間盤(pán)組織細(xì)胞代謝并維持平衡，提高骨折椎間盤(pán)二聚糖黏附細(xì)胞數(shù)量，降低骨折局部毛細(xì)血管通透性，減少炎性浸潤(rùn)及滲出，增加椎間盤(pán)二聚糖的分泌與合成，降低破骨細(xì)胞分化從而誘導(dǎo)新骨及骨痂形成，而達(dá)到促進(jìn)骨折修復(fù)的作用。