趙曉陽，鄧立志，鄧宇斌，萬勇，張黎明

1 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 脊柱外科，廣東 廣州 510080

2 中山大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510080

3 中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院 骨科研究中心，廣東 深圳 518107

神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs) 具有向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力[1]，在中樞系統(tǒng)損傷疾病(例如脊髓損傷、腦梗死等) 中移植NSCs可以與宿主損傷的組織整合，替代丟失的細(xì)胞，宿主神經(jīng)元可以與移植神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元形成突觸連接，重建局部神經(jīng)環(huán)路，在利用NSCs移植治療大鼠脊髓損傷實(shí)驗(yàn)中，可觀察到大鼠不同程度的運(yùn)動功能恢復(fù)[2-3]。然而神經(jīng)干細(xì)胞移植治療面臨一大障礙，即移植的 NSCs有限的神經(jīng)元分化率與較低的存活率的問題[4]。

絲素蛋白(Silk)作為天然生物材料具有良好的生物相容性[5]，其最終的降解產(chǎn)物是可被身體吸收的氨基酸和寡肽[6]。在許多研究中，將絲素蛋白作為生物材料支架能夠促進(jìn)嗅鞘細(xì)胞和干細(xì)胞生長和分化[7-9]。然而絲素蛋白大部分為惰性蛋白，細(xì)胞對其黏附能力不強(qiáng)，導(dǎo)致其作為搭載細(xì)胞的生物材料支架作用受限。

左旋聚賴氨酸(poly(l-lysine)) ,PLL) 不僅可以提供細(xì)胞的黏附位點(diǎn)，其本身還具有正電荷可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化，已有實(shí)驗(yàn)表明將PLL與水凝膠相連可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的黏附并提高細(xì)胞活力[10-11]。

綜上所述，我們結(jié)合兩種材料的優(yōu)勢，用聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜，并以 NSCs作為種子細(xì)胞，觀察其在聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜上的生長和和分化情況，尋找適合中樞神經(jīng)組織工程的支架材料，為中樞神經(jīng)損傷后的再生和修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料合成部分

1.1.1 原料與試劑

桑蠶繭(Bombyx morisilkworm Cocoon)，購自南寧東桑西移絲綢有限公司；碳酸鈉、乙酸乙酯、碳酸氫鈉、無水硫酸鎂、溴化鉀、四氫呋喃均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸(Nε-Carbobenzoxy-L-lysine)，二(三氯甲基)碳酸酯(三光氣)，二甲基亞砜(99.7%，Extra Dry，with molecular sieves，Water≤50 ppm)，均購自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；除四氫呋喃使用前經(jīng)金屬鈉回流除水外，其余均直接使用。

1.1.2 測試方法

1H NMR測試：端基為N-Boc-苯胺的聚賴氨酸芐酯(B-Aniline-PLL) 溶于氘代三氟乙酸(CF3COOD) 和氘代氯仿(CDCl3) 混合溶劑(V(CF3COOD)∶V(CDCl3)=15∶85)， 濃 度 為10 mg/mL。脫保護(hù)的帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL)、絲素蛋白(Silk) 和絲素蛋白-聚賴氨酸接枝物(Silk-PIL) 凍干樣品溶于重水，樣品濃度為10 mg/mL，利用400 M超導(dǎo)核磁共振譜儀Bruker AVANCE 400(Bruker Co.，Switzerland) 對樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行1H NMR表征。

UV-vis測試：用紫外-可見雙光束分光光度計(jì)(TU-1901，北京普析通用) 測量再生絲素蛋白水溶液與接枝聚賴氨酸絲素溶液的 UV-vis吸收光譜，掃描范圍：300-600 nm。

GPC測試：利用凝膠滲透色譜儀 Waters Breeze GPC(Waters Co.，USA) 測量分子量以及分子量分布系數(shù)。實(shí)驗(yàn)條件：選用Waters ultrastyragel色譜柱和2417型示差檢測器，流動相為色譜純級DMF(含0.01 mol/L LiBr)，柱溫為50 ℃，流速為1 mL/min。

掃面電鏡(SEM) 觀察：用掃面電鏡(OXFORD，Quanta400F) 檢測制備的絲蛋白膜表面結(jié)構(gòu)。

1.1.3 再生絲素原液的制備

按浴比1∶50將蠶繭加入0.02 mol/L的碳酸鈉溶液中，煮沸30 min，用去離子水漂洗，上述步驟重復(fù)兩遍，然后用溫水漂洗兩次，擰干扯松，鼓風(fēng)干燥箱60 ℃干燥。按15%(W/V) 的比例將絲素蛋白溶于9.3 mol/L 的LiBr溶液，60 ℃溶解1 h，裝入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋，25 ℃透析3 d，每6 h換一次水，然后置于pH為9的硼酸緩沖液透析1 d，4 ℃保存。

1.1.4 帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL) 的合成

將5.0 g Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸分散于50 mL經(jīng)NaH除水處理的四氫呋喃，氬氣保護(hù)下，加熱至55 ℃，加入3.5 g 三光氣，反應(yīng)1 h，旋蒸除去溶劑，加入100 mL乙酸乙酯溶解，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌3次，分離出有機(jī)相，用無水硫酸鎂干燥24 h，過濾后旋蒸除去乙酸乙酯，得到Nε-芐氧羰基賴氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐(zLL-NCA)。

將1.6 g 單體Nε-芐氧羰基賴氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐溶于30 mL DMF，加入73 mg 的引發(fā)劑N-Boc-苯胺，單體與引發(fā)劑的比例([M0]/[I0]) 為30，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，25 ℃反應(yīng)3 d，反應(yīng)結(jié)束，裝入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋，去離子水中透析2 d除去DMF，得到端基為 N-Boc-苯胺的聚Nε-芐氧羰基賴氨酸(B-Aniline-PzLL)。冰浴下，按照100 mg/mL TFA的濃度將B-Aniline-PzLL溶于三氟乙酸，滴加1/3三氟乙酸體積的氫溴酸，滴加完畢后撤去冰浴，室溫反應(yīng)2 h，旋蒸除去三氟乙酸和氫溴酸，加適量去離子水溶解，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液中和多余的酸，透析3 d，凍干得到帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL) ，反應(yīng)路線(圖1A)。

1.1.5 聚賴氨酸修飾絲素蛋白的制備

將40 mg帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL)，溶于2.5 mL純水，加入1.25 mL對甲苯磺酸一水合物(0.10 mmol) 溶液，滴加1.25 mL的亞硝酸鈉(0.05 mmol) 水溶液，反應(yīng)10 min，上述溶液混合均在冰浴中進(jìn)行，加入20 mL 經(jīng)硼酸緩沖液透析處理的再生絲素蛋白水溶液，冰水浴中反應(yīng)30 min，裝入截留分子量為8 000 Da的纖維素透析袋，純水中透析3 d除去鹽和未反應(yīng)的聚賴氨酸，每半天換一次水(圖1B)。

1.1.6 聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜的制備

取2 mL 1.1.5制備的聚賴氨酸修飾絲素蛋白水溶液加入24孔板，40 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥12 h，加入80%的乙醇水溶液，放置20 min誘導(dǎo)絲素蛋白構(gòu)象變化，去掉溶劑，自然干燥，得到穩(wěn)定不水溶的聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜，用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs) 的分離、培養(yǎng)和鑒定

實(shí)驗(yàn)中采取孕 16–18 d胚胎 SD大鼠腦組織(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣州，中國) 在 Hanks平衡鹽溶液中機(jī)械切割和分離腦組織，并將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min。棄上清，細(xì)胞沉淀稀釋成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶(Corning) 中，用 DMEM/F12培養(yǎng)基(含有 2%B27(Gibco)，1%青霉素/鏈霉素，1% L-谷氨酰胺(Gibco)，20 ng/mL成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)(Peprotech) 和 20 ng/mL表皮生長因子(EGF)(Peprotech)) 在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。用Accutase酶(Millipore) 每周消化傳代。這項(xiàng)研究中均使用第3代NSC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)之前用免疫熒光進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞鑒定。

1.2.2 CCK-8檢測

第2代神經(jīng)干細(xì)胞球用Accutase酶消化分解為單個細(xì)胞，并種植于預(yù)先用絲素蛋白膜(Silk)、聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜(Silk-PIL) 和多聚賴氨酸(PLL) 包被好的24孔板(Corning) 中，每孔的細(xì)胞密度為1×105cells/mL，每孔總體積為1 mL，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。分別在1、3、5、7 d時加入10 μL CCK8試劑(Jangsu KeyGEN BioTECH Corp.，Ltd)，37 ℃避光孵育3 h，之后將上清液吸入至 96孔板中在 450 nm波長下進(jìn)行吸光度(OD) 值測定，使用空白對照孔調(diào)零，OD值相對于空白對照組越高表明細(xì)胞活力越好，反之則越差。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 NSCs誘導(dǎo)分化

第2代神經(jīng)干細(xì)胞球用Accutase酶消化分解為單個細(xì)胞，并種植于預(yù)先用絲素蛋白膜(Silk)、多聚賴氨酸(PLL) 和聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜(Silk-PIL) 包被好的24孔板(Corning,Acton，MA)中，每孔的細(xì)胞密度為1×105cells/mL，每孔總體積為1 mL，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。24 h之后，將原來培養(yǎng)基吸出，換分化培養(yǎng)基(無 EGF和FGF) 培養(yǎng)1周。

1.2.4 免疫熒光染色分析

誘導(dǎo)NSCs分化1周后，將24孔板中的細(xì)胞(n=3) 上清液吸去，用PBS洗3遍，每次5 min，之后加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗3遍，每次5 min。分別以0.3% Triton X-100透膜和10%山羊血清封閉30 min，去除血清，以適當(dāng)濃度一抗孵育，4 ℃過夜。次日將標(biāo)本復(fù)溫，PBS洗3次，每次5 min，用熒光二抗于常溫下避光孵育1 h。去除熒光二抗，PBS洗 2次，以 DAPI(Thermo Fisher) 染核15 min。PBS洗2次，將標(biāo)本置于熒光顯微鏡下觀察。所用一抗如下：神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物 Nestin(1∶200，CST)、SOX2(1∶200，CST)、新生神經(jīng)元標(biāo)志物 β3-tubulin(1∶200，CST)、成熟神經(jīng)元標(biāo)志物 MAP2(1∶200，CST)。所用二抗如下：FTIC標(biāo)記羊抗兔或羊抗小鼠抗體(1∶200)。

1.2.5 Western blotting分析

神經(jīng)干細(xì)胞分別在不同處理組上培養(yǎng)7 d后進(jìn)行蛋白提取(n=3)。用RIPA(Santa Cruz) 進(jìn)行裂解，提出的蛋白用 BCA(Beyotime) 法測其濃度，統(tǒng)一蛋白上樣量為 20 μg，蛋白樣品利用SDS-PAGE(10% Bis-Tris Gel) 進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5% BSA進(jìn)行封閉，一抗4 ℃過夜，對應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，最后以加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影(ECL system，Millipore)。所用一抗如下：Bax(1∶1 000，CST)、Bcl-2(1∶1 000，CST)、GAPDH(1∶1 000，CST)。各蛋白水平以GAPDH作為參照。

1.2.6 TUNEL分析

采用TUNEL染色法(Roche，Basel，Swiss)檢測NSCs在不同處理組上培養(yǎng)7 d的細(xì)胞凋亡情況。先用 4%多聚甲醛在室溫下固定 10 min，用PBS洗兩次，每次 10 min，接著用 0.2% Triton X-100進(jìn)行透膜30 min，用PBS洗2次，加TUNEL試劑避光37 ℃孵育1 h，之后用PBS再洗2次，加DAPI染核15 min。熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞分布區(qū)域隨機(jī)選取5個不重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)(顯紅色熒光)。

1.2.7 Real-time PCR分析

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF) 是神經(jīng)干細(xì)胞分泌的一種營養(yǎng)因子，對神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化、存活有重要的影響。神經(jīng)干細(xì)胞分別在不同處理組上培養(yǎng) 7 d后，用RT-PCR技術(shù)檢測兩組神經(jīng)干細(xì)胞BDNF mRNA水平，具體操作見 RNA提取試劑盒(TaKaRa)、PrimeScript RT Reagent Kit和SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa) 說明書，引物序列見表2。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析和制圖

所有的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用 SPSS 16.0和 GraphPad Prism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖，結(jié)果用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。*P＜0.05為顯著，**P＜0.01為極顯著。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 聚賴氨酸修飾絲素蛋白合成圖Fig.1 Synthesis of Aniline-PIL modified silk.(A) Synthetic road map of Aniline-PIL.(B) Synthetic road map of Aniline-PIL modified silk.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜的合成

圖 2A是絲素蛋白與經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白水溶液的紫外-可見光譜圖，兩相比較，經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白水溶液在352 nm發(fā)生強(qiáng)紫外吸收，393 nm處出現(xiàn)一個肩峰，這兩處的紫外吸收由酪氨酸殘基與苯胺基團(tuán)偶聯(lián)形成的偶氮苯結(jié)構(gòu)造成[12]，說明聚賴氨酸成功通過化學(xué)偶聯(lián)的辦法接枝到絲素蛋白骨架上。圖2B是絲素蛋白和經(jīng)聚賴氨酸修飾絲素蛋白的核磁共振譜圖，與純的絲素蛋白比較，經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白在δ 3.00附近出現(xiàn)屬于聚賴氨酸重復(fù)單元中殘基上亞甲基的質(zhì)子化學(xué)位移。與絲素蛋白和經(jīng)聚賴氨酸修飾絲素蛋白溶液的紫外-可見光譜的數(shù)據(jù)一同說明，聚賴氨酸通過酪氨酸殘基與苯胺的反應(yīng)成功接枝到絲素蛋白上。掃描電鏡觀察顯示，絲素蛋白膜呈纖維狀三維立體結(jié)構(gòu)，纖維分布均勻，孔隙大小為5-30 μm(圖2C)。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定及增殖活性分析

圖2 絲素蛋白膜與經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜的檢測和觀察Fig.2 UV-vis spectra and 1H NMR spectra of Silk and Silk-PIL.(A) UV-vis spectra of Silk and Silk-PIL.(B) 1H NMR spectra of Silk and Silk-PIL.(C) Observation of Silk and Silk-PIL by SEM.

所用細(xì)胞經(jīng)免疫熒光檢測均表現(xiàn)為Nestin和SOX2 陽性(圖 3A)，提示所用細(xì)胞為 NSCs。NSCs在不同處理組上生長7 d(圖3B)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，第1天時Silk組(0.150±0.017)，PLL組(0.163±0.036) 與 Silk-PIL 組(0.176±0.03) 的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力無明顯差異(P=0.582)，但隨著時間推移，第3天、第5天、第7天3組CCK-8檢測結(jié)果顯示，Silk+PIL 組(0.335±0.039、0.511±0.055、0.671±0.078)相 比 于 Silk 組(0.242±0.030、0.305±0.036、0.408±0.022)，細(xì)胞增殖能力顯著提高(P=0.032，P=0.006，P=0.005)，而相比于 PLL組(0.319±0.031、0.435±0.074、0.615±0.063) 并無顯著性差異(圖3C)。

2.3 免疫熒光檢測NSCs分化

在不同材料上誘導(dǎo)NSCs分化7 d后，用免疫熒光的方法檢測 NSCs分化成神經(jīng)元(包括新生神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元) 和星型膠質(zhì)細(xì)胞的面積(圖 4A)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Silk-PIL組中新生神經(jīng)元標(biāo)志物 β3-tubulin陽性的細(xì)胞面積顯著高于Silk組(P=0.034)，對于成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2來說，Silk-PIL組中陽性細(xì)胞面積顯著高于 Silk組(P=0.009)，而相對于 PLL組，無論是新生神經(jīng)元標(biāo)志物 β3-tubulin還是成熟神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2，兩組之間并無顯著性差異(P=0.541；P=0.347)。三組星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP的陽性面積并無顯著性差異(P=0.753)(圖4B)。

2.4 Western blotting、TUNEL和 Real-time PCR分析

TUNEL檢測結(jié)果表明，Silk組的凋亡細(xì)胞數(shù)量要明顯多于 Silk-PIL和 PLL組(P=0.04)(圖5A、D)。Bax為細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白，其表達(dá)量增高可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，Bcl-2為胞內(nèi)抑制凋亡蛋白，其表達(dá)量增高可抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，Bax/Bcl-2的高低可反映細(xì)胞凋亡程度的高低[13]。在此實(shí)驗(yàn)中，NSCs分別在Silk、PLL和Silk-PIL上培養(yǎng)7 d后，Western blotting檢測了Bax和Bcl-2的表達(dá)水平(圖5A)。Silk組Bax/Bcl-2水平顯著高于Silk-PIL組(P=0.024)(圖5B、C)，證明Silk組的 NSCs細(xì)胞凋亡程度較 Silk-PIL組高，Silk-PIL與PLL組之間Bax/Bcl-2水平無顯著性差異。通過Real-time PCR發(fā)現(xiàn)Silk-PIL和PLL組NSCs中BDNF的mRNA表達(dá)量顯著高于Silk組(P=0.03)(圖 5E)。

圖5 TUNEL檢測凋亡細(xì)胞(A、D)、凋亡相關(guān)蛋白Bax和 Bcl-2的表達(dá)(B、C) 和神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF mRNA表達(dá)情況(E)Fig.5 TUNEL and Western blotting analysis of the levels of apoptotic cells(A,D) and Bax/Bcl-2 apoptosis-related protein(B,C).The levels of BDNF mRNA was detected by Q-PCR(D).Scale bar=100 μm.

3 討論

正如許多研究所述，NSCs能夠自我更新，可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這種性質(zhì)可以使其補(bǔ)充中樞系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的缺失[14]，從而形成有功能的神經(jīng)回路，其次，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，NSCs也能夠分泌諸多營養(yǎng)因子(如BDNF、NT-3等)，為神經(jīng)和軸突再生提供良好的生存環(huán)境[15]，綜上，NSCs是中樞神經(jīng)后移植修復(fù)的種子細(xì)胞。但如前文所述，NSCs也有其自身的缺點(diǎn)，如向神經(jīng)元分化少、存活率低等，因此如何用適合的材料攜帶NSCs并促進(jìn)NSCs在其上的存活和向神經(jīng)元分化是亟待解決的問題。

研究表明，理想的組織工程材料應(yīng)具備以下幾個特性[16]：1) 具有良好的強(qiáng)度和理化性質(zhì)；2)材料來源廣泛且易加工成型，可塑性強(qiáng)；3) 具有良好的生物相容性，其自身及降解產(chǎn)物對細(xì)胞和機(jī)體無毒性，不會或較少引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)；4) 生物降解速率與組織再生速率相匹配，最終可被充分吸收或安全排出體外；5) 良好的表面相容性，有足夠的細(xì)胞吸附能力，支持細(xì)胞的黏附、生長、增殖、分化。

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然的高分子纖維蛋白，具有良好的理化特征和生物性能[17-18]。絲素被用作縫合線后，現(xiàn)在又被重新審視作為一種有廣泛應(yīng)用潛能的生物材料而煥發(fā)新生。

有研究者認(rèn)為絲素蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度高、良好的生物相容性、生物降解性緩慢、制備方法多樣易得、能夠支持多種細(xì)胞的黏附、分化和生長[19-21]。已有研究實(shí)驗(yàn)將絲素蛋白作為成骨、韌帶、肌腱、血管的組織工程支架，取得了良好的效果[22]。但絲素蛋白也有其自身的缺點(diǎn)，其主要成分為惰性蛋白，作為細(xì)胞載體與細(xì)胞黏附力較弱。

在此項(xiàng)研究中，我們用NSC作為種子細(xì)胞，并用聚賴氨酸修飾絲蛋白，增加絲蛋白中帶正電荷的基團(tuán)，增加其對細(xì)胞的粘附性，觀察其對NSCs增殖和分化的影響。經(jīng)CCK-8檢測結(jié)果顯示，NSCs在用聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上細(xì)胞活力增殖速度顯著高于未經(jīng)修飾的絲蛋白膜，Western blotting 檢測也表明NSCs在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上促凋亡蛋白Bax與抑凋亡蛋白Bcl-2比值顯著低于單純絲蛋白組，證明 NSCs在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上細(xì)胞凋亡更少，存活率更高。免疫熒光檢測NSCs分化結(jié)果表明，NSC在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上分化的神經(jīng)元數(shù)量顯著多于其在單純絲蛋白膜上的神經(jīng)元數(shù)量，這表明聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜能夠促進(jìn) NSCs向神經(jīng)元方向分化。不僅如此，RT-PCR結(jié)果提示，NSC在用聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上BDNF mRNA水平更高。BDNF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進(jìn)神經(jīng)生長，增加神經(jīng)細(xì)胞的存活率，并且也有實(shí)驗(yàn)證明，BDNF能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，但向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化影響不大，這或許是導(dǎo)致 NSCs在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上分化的神經(jīng)元數(shù)量顯著多于其在單純絲蛋白膜上的神經(jīng)元數(shù)量而膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量卻沒有差異的原因之一[23-24]。同時，實(shí)驗(yàn)組 Silk-PIL在材料上的形態(tài)、數(shù)量、黏附性與PLL組無顯著差異，說明多聚賴氨酸修飾的絲素蛋白能為 NSCs的黏附和生長分化提供良好的生長表面。

應(yīng)用絲蛋白膜作為修復(fù)神經(jīng)損傷材料也有其相對的局限性：比如絲蛋白的β折疊結(jié)晶易被破壞，降低了其力學(xué)性能[25]；其次，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明將絲蛋白作為神經(jīng)修復(fù)材料在體內(nèi)降解速度較為緩慢[26-27]，神經(jīng)系統(tǒng)中并無絲蛋白成分，將其作為基質(zhì)材料，在體內(nèi)的效果需要進(jìn)一步觀察。盡管此研究表明用聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜可以促進(jìn) NSCs增殖并促進(jìn)其向神經(jīng)元方向分化，但其中的機(jī)制還需進(jìn)一步探究。如果進(jìn)一步將其作為一種理想的細(xì)胞移植支架，尚需觀察其移植體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)，只有對此材料進(jìn)行全面和綜合的實(shí)驗(yàn)分析評價，才能為其在神經(jīng)再生領(lǐng)域的應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。