成希飛，楊沙，陳果，趙一萍，彭婭林，周游，徐立*

1(西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶，401121)

蠶絲中，絲素蛋白占總質(zhì)量的70%～80%，絲膠蛋白占20%～30%[1]。絲素蛋白是一種纖維蛋白，由于其優(yōu)良的生物相容性、低炎癥反應(yīng)、良好的力學(xué)性能[2-4]，絲素蛋白受到越來越多的矚目，是一種極具吸引力的生物材料。工業(yè)生產(chǎn)及制種過程中會產(chǎn)生大量的廢蠶繭，將這些廢蠶繭水解成具有功能活性的絲素肽，是家蠶蠶絲開發(fā)應(yīng)用的重要內(nèi)容之一[5]。目前，該類產(chǎn)品已經(jīng)被應(yīng)用在功能食品[6]、醫(yī)藥工業(yè)[7]、骨組織再生[8]、傷口愈合[9]等生物學(xué)領(lǐng)域中。

由于天然絲素不溶于水，絲素肽的獲得一般采用化學(xué)水解法，包括酸水解或者堿水解法。但這種水解方法存在諸多弊端，如色氨酸被破壞生成一種暗黑色不溶物，絲氨酸、蘇氨酸也遭部分破壞；用鹽酸水解制成的絲素粉末呈黃褐色，且有惡臭產(chǎn)生[10]。將絲素蛋白溶解后，利用酶催化水解絲素蛋白，組成蛋白質(zhì)的氨基酸不會被破壞，且酶具有專一性，不同的酶可以得到不同的酶解產(chǎn)物，水解程度容易控制，具有較強(qiáng)的優(yōu)越性。

過去的幾十年中，人們發(fā)現(xiàn)大量使用傳統(tǒng)抗生素容易誘導(dǎo)耐藥性菌株的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致治療同種感染時抗生素的使用量越來越多[11-13]，陷入一種惡性循環(huán)模式，因此開發(fā)新型抗生素極為迫切[14]。酶法制備抗菌肽酶解條件易控制且環(huán)保，被認(rèn)為是抗菌肽大批量生產(chǎn)最有前途的方法之一[15]。因此本文以絲素蛋白為原料，采用蛋白酶酶解法制備絲素肽，并對絲素肽進(jìn)行高效液相色譜分析，評價絲素肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性以及對人胚腎細(xì)胞(HEK293)的毒性，為絲素肽的制備及應(yīng)用提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)蠶絲行業(yè)中的“變廢為寶”。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌由西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗中心保存。

Na2CO3、CaCl2、C2H5OH、NaCl、瓊脂(分析純)，重慶川東化工有限公司；堿性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4 AU/g)、 木瓜蛋白酶Papain(6.0×105U/g)，丹麥Novo酶制劑公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英國Oxiod公司；甲醇、乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；MTT試劑盒、DMSO，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙抗溶液、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS，美國Hyclone公司；胎牛血清，上海ExCell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Essential15純水儀，法國Millipore公司；VS-1300L-U超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫水浴鍋，上海柏欣儀器設(shè)備廠；SPX-270生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀，美國Biotek公司；Bioscreen C全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司；E2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Modulyod冷凍干燥機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；超低溫冰箱，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 蠶絲脫膠

蠶絲脫膠參考馬駿等[16]的方法。將廢削口蠶繭用自來水清洗干凈，40～60 ℃烘箱烘干。準(zhǔn)確稱量20 g蠶繭裝入燒杯中，加入10 g/L的無水碳酸鈉溶液，浴比1∶40，煮沸30 min后，用去離子水充分洗滌。采用苦味酸胭脂紅法進(jìn)行檢驗，取脫膠后的蠶絲加入1 mL苦味酸胭脂紅溶液，加溫煮沸5 min，分別取出脫膠蠶絲，用水沖洗后觀察蠶絲顏色。若是明黃色，則表明蠶絲上的絲膠蛋白已脫干凈；若是紅色，則表示絲素上仍然有絲膠蛋白殘留，需繼續(xù)脫膠，直至脫凈為止。將脫膠好的絲素40～60 ℃烘干，稱量并計算脫膠率如公式(1)所示。

(1)

式中：W1為脫膠前蠶絲的質(zhì)量,g；W2為脫膠后絲素的質(zhì)量，g。

1.3.2 絲素蛋白粉末的制備

將烘干后的脫膠絲素加入n(CaCl2)∶n(C2H5OH)∶n(H2O)=1∶2∶8三元體系溶液中[17]，浴比為1∶10，(72±2)℃水浴中溶解2 h。所得絲素蛋白鹽溶液置于透析袋(分子截留量4 000 Da)中蒸餾水透析48 h，每12 h換1次水。透析后的絲素蛋白溶液倒入培養(yǎng)皿中，放入-80 ℃超低溫冰箱中預(yù)冷凍2 h，然后放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥48 h，得到白色的絲素蛋白粉末，色澤良好。

1.3.3 酶解絲素肽的制備

絲素蛋白的酶解參考羅美琪等的方法[18-19]。

堿性蛋白酶(alcalase, A)酶解：取一定量的絲素蛋白，設(shè)置底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，E/S=2%(E為酶的質(zhì)量，S為底物質(zhì)量)，pH 8.5，溫度60 ℃，在以上條件下反應(yīng)1～5 h，獲得不同水解度絲素肽樣品，分別用A1、A2、A3、A4、A5來標(biāo)記(下文均如此表示)。每小時反應(yīng)結(jié)束后將樣品升溫到85 ℃保溫15 min，使酶滅活，將所得絲素肽溶液過0.22 μm濾膜，制得酶解絲素肽樣品。木瓜蛋白酶(papain,P)酶解：設(shè)置底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，E/S=2%，pH 7.5，溫度50 ℃，反應(yīng)時間1～5 h，分別用P1、P2、P3、P4、P5來標(biāo)記(下文均如此表示)，其余制備操作過程同上。絲素蛋白水解度(the degree of hydrolysis, DH)的測定采用pH-state法[20]，如公式(2)所示。

(2)

式中：B為堿液的體積,mL；Nb為堿液的濃度，mol/L；α為氨基的解離度；Mp為底物中蛋白質(zhì)總含量，g；htot為底物絲素蛋白中的肽鍵濃度(htot=12.4 mmol/g)。

1.3.4 絲素肽反相高效液相色譜分析

絲素肽反相高效液相色譜分析參考倪莉等的方法[21-22]，但略有修改。

HPLC系統(tǒng)：Waters E2695，色譜柱：C18SunFire(5 μm， 4.6 mm×250 mm，美國Waters公司)；檢測器：PDA檢測器；檢測波長：228 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃；洗脫液流速：1 mL/min；洗脫條件：A1～A5：0～10 min 95% A，10～20 min 5% B～15% B，20～30 min 15% B，30～35 min 15% B～5% B，35～38 min 95% A(A液：水；B液：乙腈)；P1～P5：體積分?jǐn)?shù)為45%乙腈水溶液(含0.1%三氟乙酸)。

1.3.5 絲素肽抑菌性檢測

菌懸液的制備：無菌條件下，將﹣80 ℃冰箱保藏的菌種連續(xù)轉(zhuǎn)接2次。取活化后的新鮮菌液接種至LB固體培養(yǎng)基，采用平板稀釋法確定菌液濃度，用LB液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至104CFU/mL置于4 ℃冰箱備用。

絲素肽抑菌性檢測參考翁佩芳等的方法[23]，但略有修改。在無菌96孔培養(yǎng)板上的孔2～4中加入100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基，取按1.3.3方法制備的不同水解度絲素肽100 μL加入孔1和孔2，混勻孔2，再從孔2中吸出100 μL到孔3，混勻孔3，再從孔3中吸出100 μL到孔4，混勻孔4，從孔4中吸出100 μL 棄去，這樣每孔對應(yīng)的絲素肽質(zhì)量濃度分別為50、25、12.5、6.25 mg/mL。接著在每個孔中接入備用菌液100 μL，這樣每孔絲素肽終質(zhì)量濃度為25、12.5、6.25、3.125 mg/mL，以不加絲素肽的無菌水為陰性對照，每個處理重復(fù)3次。由于絲素肽中含有滅活的蛋白酶，為了說明這些蛋白酶對抗菌性的影響，按照酶解體系中E/S=2%的蛋白酶添加量做木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶對照，85 ℃保溫15 min，將蛋白酶滅活，溶液過0.22 μm濾膜，制得滅活蛋白酶溶液。按上文中絲素肽加樣方法，將蛋白酶溶液、無菌LB液體培養(yǎng)基及菌液加入96孔培養(yǎng)板中2種蛋白酶終質(zhì)量濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL。采用酶標(biāo)儀在600 nm波長測OD值后，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h， 再次測定此培養(yǎng)板各孔OD600值，計算各孔ΔOD600值。選擇抑菌效果較好的絲素肽濃度按上述方法加樣，置于全自動生長曲線分析儀中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定并記錄菌懸液OD600值，相同過程重復(fù)3次，求平均值。以生長時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.3.6 MTT法檢測絲素肽對HEK293細(xì)胞的毒性[24]

HEK293細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵箱中培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時按1:3比例傳代。將生長旺盛處于對數(shù)期的細(xì)胞通過血球計數(shù)板計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為105個/mL左右，將100 μL細(xì)胞懸液加入無菌96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，24 h后舍棄原培養(yǎng)液。將50 mg/mL A1、A2、A3、A4、A5、P1、P2、P3、P4、P5絲素肽溶液過0.22 μm濾膜除菌后與培養(yǎng)基1:1混合，取100 μL混合溶液至96孔板中，絲素肽終質(zhì)量濃度為25 mg/mL，每組設(shè)3個重復(fù)，另外設(shè)陰性對照組(不含絲素肽的無菌水)。37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照MTT試劑盒說明書方法操作檢測細(xì)胞活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲素脫膠率及不同酶酶解絲素蛋白的水解度

蠶絲脫膠率為(29.9±3.68)%，與WANG等[25]研究結(jié)果一致，說明1.3.1中脫膠方法可行。由圖1可以看出，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解絲素蛋白的水解度隨著時間增長而逐漸增大，堿性蛋白酶酶解絲素蛋白能力較強(qiáng)，水解度較大，為18.95%～26.84%。而木瓜蛋白酶酶解絲素蛋白能力較弱，水解度較小，為0.26%～1.12%。

a-不同時間木瓜蛋白酶酶解絲素蛋白的水解度;b-不同時間堿性蛋白酶酶絲素蛋白的水解度圖1 木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解絲素蛋白1～5 h的水解度Fig.1 Hydrolysis degree of silk fibroin digested by papain and alcalase in 1-5 h

2.2 不同酶解產(chǎn)物絲素肽的抑菌性

比濁法測定化學(xué)物質(zhì)濃度的原理基于朗伯-比爾定理，即在一定波長和一定液層厚度條件下吸光度與稀溶液的濃度成正比。本實(shí)驗樣品為蛋白質(zhì)或多肽，經(jīng)全波長掃描得知，實(shí)驗樣品最大吸收波長均在210～300 nm。對于菌懸液，一般選用600 nm作為測定波長，實(shí)驗樣品在600 nm處無吸收，不會產(chǎn)生干擾，所以本抑菌實(shí)驗檢測波長選擇600 nm，ΔOD600值越大，說明菌體生長越旺盛[26]。

由表1可以看出，4個不同濃度的木瓜蛋白酶溶液ΔOD600值均小于陰性對照，4個不同濃度的堿性蛋白酶溶液ΔOD600值均大于陰性對照，但2種酶溶液相對陰性對照P值均大于0.05，說明2種蛋白酶對金黃色葡萄球菌生長無顯著性影響。

由表2可以看出，25、12.5、6.25 mg/mL的A4、A5、A1、A2絲素肽ΔOD600值均大于陰性對照，而且P值均小于0.05，有些P值甚至小于0.001，說明和陰性對照相比這4種絲素肽具有顯著性甚至極顯著性差異，由此推斷A4、A5、A1、A2沒有抑制金黃色葡萄球菌生長的性質(zhì)，反而可以促進(jìn)金黃色葡萄球菌生長。25 mg/mL的A3絲素肽ΔOD600值大于陰性對照且P<0.05，說明該濃度下A3可以促進(jìn)金黃色葡萄球菌生長。25、12.5 mg/mL的P1、P3、P5、P4絲素肽ΔOD600值均小于陰性對照，25 mg/mL的P2絲素肽ΔOD600值小于陰性對照，且在25 mg/mL質(zhì)量濃度下P1絲素肽的P<0.01；P2、P3絲素肽的P值均小于0.05，說明P1、P2、P3與陰性對照具有顯著性差異，由此我們認(rèn)為，此3種絲素肽在25 mg/mL質(zhì)量濃度下對金黃色葡萄球菌生長具有較強(qiáng)的抑制作用，下一步繪制金黃色葡萄球菌在終質(zhì)量濃度為25 mg/mL的P1、P2、P3絲素肽作用下培養(yǎng)24 h的生長曲線，進(jìn)一步說明這3種絲素肽對于金黃色葡萄球菌的抑制作用。

表1 金黃色葡萄球菌懸液在不同質(zhì)量濃度滅活蛋白酶作用下培養(yǎng)24 h的ΔOD600值(x±s,n=3)Table 1 The value of ΔOD600of Staphylococcus aureus suspension with different concentration of inactivated protease after 24 h(x±s,n=3)

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下同。

表2 金黃色葡萄球菌懸液在不同質(zhì)量濃度絲素肽作用下培養(yǎng)24 h的ΔOD600值(x±s,n=3)Table 2 The value of ΔOD600of Staphylococcus aureus suspension with different concentration of silk fibroin peptide after 24 h(x±s,n=3)

由表3可以看出0.5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液ΔOD600值小于陰性對照，而其他3個濃度的ΔOD600值均大于陰性對照組，且前3個濃度下與陰性對照具有顯著性差異，說明0.5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液對大腸桿菌有一定的抑制作用，而0.25、0.125 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液可以促進(jìn)大腸桿菌的生長。4個不同濃度的堿性蛋白酶溶液ΔOD600值均大于對照組，只有在0.5 mg/mL濃度下與陰性對照有顯著性差異，說明此濃度下堿性蛋白酶可以促進(jìn)大腸桿菌生長，而后3個濃度的堿性蛋白酶溶液與陰性對照無顯著性差異。

表3 大腸桿菌懸液在不同質(zhì)量濃度滅活蛋白酶作用下培養(yǎng)24 h的ΔOD600值(x±s,n=3)Table 3 The value of ΔOD600of Escherichia coli suspension with different concentration of inactivated protease after 24 h(x±s,n=3)

由表4可以看出，P1、A2、A4、A1、P4、A3及A5絲素肽在4個不同濃度下的ΔOD600值均小于陰性對照。

A2絲素肽在4個濃度下與陰性對照均有顯著性差異，且在25、12.5、3.125 mg/mL時P<0.001，說明與陰性對照相比具有極顯著性差異，由此推斷所有酶解產(chǎn)物里A2對于大腸桿菌抑菌效果最好。25 mg/mL 的P1、A2、A4、A1絲素肽的P值均小于0.05， 說明該濃度下4種絲素肽均有一定抑制大腸桿菌生長的性質(zhì)，其余絲素肽與陰性對照無顯著性差異，沒有抑菌性質(zhì)。下一步繪制大腸桿菌在終質(zhì)量濃度為25 mg/mL的P1、A2、A4、A1絲素肽條件下培養(yǎng)24 h的生長曲線，來進(jìn)一步分析這4種絲素肽對大腸桿菌的抑制作用。

表4 大腸桿菌懸液在不同質(zhì)量濃度絲素肽作用下培養(yǎng)24 h的ΔOD600值(x±s,n=3)Table 4 The value of ΔOD600of Escherichia coli suspension with different concentration of silk fibroin peptide after 24 h(x±s,n=3)

菌懸液加入終質(zhì)量濃度為25 mg/mL的絲素肽中生長曲線如圖2所示。由圖2可以看出，P1絲素肽水解度較低，所以初始OD600值較大，對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種菌懸液來說，加入P1后菌體生長曲線幾乎為一條直線，說明菌體生長都得到了很大抑制，幾乎沒有生長，抑菌效果較好。

由圖2-a可以看出，陰性對照組大腸桿菌菌體在2 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，旺盛生長4 h左右，6 h開始生長放緩，18 h左右進(jìn)入平臺期，18～24 h生長曲線幾乎為一條直線。加入A2、A1、A4三種絲素肽均可以明顯抑制大腸桿菌生長，菌體在0～4 h生長緩慢，4 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，相比陰性對照菌體進(jìn)入對數(shù)生長期，時間從2 h推遲到了4 h，而且加入3種絲素肽后大腸桿菌生長得到了明顯抑制，菌體增長緩慢，20～24 h 左右進(jìn)入平臺期，生長曲線幾乎為一條直線。

由圖2-b可以看出，陰性對照組金黃色葡萄球菌菌體在2 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，旺盛生長4 h左右，6 h開始生長放緩，8 h左右進(jìn)入平臺期，8～24 h生長曲線幾乎為一條直線。

a-不同絲素肽對大腸桿菌生長曲線的影響；b-不同絲素肽對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響圖2 不同絲素肽對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.2 Effects of different silk fibroin peptides on growth curve of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

加入P2、P3絲素肽后，金黃色葡萄球菌沒有進(jìn)入對數(shù)生長期，生長得到了明顯抑制。加入P3絲素肽后，金黃色葡萄球菌0～20 h幾乎沒有生長，直到20～24 h菌體才有少量增長。加入P2絲素肽后，金黃色葡萄球菌0～16 h幾乎沒有生長，16～24 h緩慢增長。相比而言，P3抑菌效果優(yōu)于P2。

綜合來看，P1絲素肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較強(qiáng)抑制作用。其次，A2絲素肽對大腸桿菌抑制作用較強(qiáng)，P3絲素肽對金黃色葡萄球菌抑制作用較強(qiáng)。

2.3 不同絲素肽對HEK293細(xì)胞的毒性

堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對HEK293細(xì)胞的毒性結(jié)果如表5所示。終質(zhì)量濃度為25 mg/mL的A1～A5、P1～P5十種絲素肽對HEK293細(xì)胞的存活率均大于100%，說明這十種絲素肽對HEK293細(xì)胞增殖無毒性。對金黃色葡萄球菌或大腸桿菌具有抑制作用的酶解產(chǎn)物A1、A2、A4、P1、P2、P3，其中A1、A2、A4及P2絲素肽P值小于0.05，說明A1、A2、A4、P2對HEK293細(xì)胞存活具有促進(jìn)作用，P1、P3絲素肽P值大于0.05說明P1、P3對HEK293細(xì)胞增殖無顯著性影響。

表5 不同絲素肽對HEK293細(xì)胞增值率變化情況(x±s, n=3)Table 5 Cell proliferation rate of HEK293 cells in different fibroin peptide (x±s, n=3)

2.4 絲素肽反相高效液相色譜圖譜

由圖3可以看出，A1～A5絲素肽吸收峰的保留時間都在2～7 min左右，但仔細(xì)對比不同絲素肽的圖譜有明顯差異，說明不同絲素肽的組分含量有一定差異。A1～A5絲素肽第1個和第2個吸收峰保留時間分別在2.47和2.61 min左右：保留時間為2.47 min左右的吸收峰峰面積隨著絲素蛋白水解度增大而明顯增大，A4該峰的峰面積達(dá)到最大，到A5有所減??；A1～A4中保留時間為2.61 min左右的吸收峰峰面積差別不大，A5有所減小。A1～A5絲素肽第3個和第4個吸收峰保留時間分別為3.15和3.45 min左右，A1～A4中這2個吸收峰峰面積逐漸增大，A4達(dá)到最大，A5中這2個吸收峰的峰面積開始減小。結(jié)合前文抑菌性結(jié)果，這4個吸收峰變化規(guī)律與前文所發(fā)現(xiàn)的絲素肽抑菌性規(guī)律沒有相關(guān)性。

圖3 A1～A5絲素肽高效液相色譜圖Fig.3 RP-HPLC chromatogram of A1-A5 silk fibroin peptide

A1絲素肽在3.85和3.95 min具有第5個和第6個吸收峰，但是從A2開始到A5，這兩個吸收峰的保留時間發(fā)生變化，分別增大至3.91和4.25 min 左右，說明隨著水解度增大，產(chǎn)生了不同的多肽。保留時間為3.91 min的吸收峰在A2絲素肽中峰面積最大，A3開始逐漸降低，A5最低。保留時間為4.25 min的吸收峰峰面積從A2開始逐步增大，到A4達(dá)到最大，A5開始降低。結(jié)合前文絲素肽抑菌性可知A2、A4、A1三種絲素肽對大腸桿菌抑菌性較好，由此可以推斷，保留時間為3.85～4.25 min的組分可能具有較好的抑制大腸桿菌生長的效果。A2～A4絲素肽在第6個吸收峰后又有幾個峰面積較小的吸收峰，但與絲素肽抑菌性規(guī)律關(guān)系不大，所以在此不做討論。

由圖4可以看出，P1～P5絲素肽吸收峰的保留時間都在3～12 min，主要差異峰保留時間在3～7 min， 因此對這段時間的吸收峰進(jìn)行對比研究，以期找到與前文抑菌性相關(guān)的結(jié)論。

圖4 P1～P5絲素肽高效液相色譜圖Fig.4 RP-HPLC chromatogram of P1-P5 silk fibroin peptide

P1～P5絲素肽第1個吸收峰的保留時間均為3.50 min 左右，峰面積逐漸增大，P4達(dá)到最大，P5開始降低。P1～P5絲素肽第2個吸收峰的保留時間在4.59 min左右，峰面積逐漸增大，P5達(dá)到最大。然而這2個吸收峰峰面積的變化規(guī)律與抑菌性沒有相關(guān)性。P1絲素肽第3個吸收峰的保留時間在5.31 min左右，P2～P3絲素肽第3個吸收峰的保留時間有所增大，大約在5.33 min左右，且峰面積逐漸增大，P3該吸收峰峰面積最大。P4～P5絲素肽第3個吸收峰的保留時間有所減小，大約在5.29 min左右，峰面積比P1～P3都大，推測這一規(guī)律與P1、P2、P3有較強(qiáng)的金黃色葡萄球菌抑菌性相關(guān)。P1～P5絲素肽第4個 吸收峰保留時間分別為5.68、5.70、5.70、5.68、5.67 min， 峰面積逐漸增大，P4和P5峰面積相同，都達(dá)到最大值，這個規(guī)律與抑菌性也沒有相關(guān)性。其余峰峰面積太小，分析意義不大。由此推斷保留時間為5.31和5.33 min的多肽具有一定的抑制金黃色葡萄球菌生長性質(zhì)，而保留時間為5.29 min的多肽對金黃色葡萄球菌的生長可能沒有抑制作用。

3 結(jié)論

本研究將廢蠶繭脫膠、溶解、透析、酶解處理后制備出具有抑制大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)及金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)生長的抗菌肽，并研究抗菌肽對人胚腎細(xì)胞(HEK293)的毒性。發(fā)現(xiàn)P1、A2、A4、A1絲素肽具有抑制大腸桿菌生長的特性，P1、P2、P3絲素肽能夠抑制金黃色葡萄球菌生長，且制備出的10種絲素肽對HEK293細(xì)胞均沒有毒性。具有抑菌作用的P1、P2、P3、A2、A4、A16種絲素肽，其中A1、A2、A4、P2絲素肽對HEK293細(xì)胞存活還具有促進(jìn)作用，說明此6種絲素肽在具有抑菌性的同時對人源細(xì)胞無細(xì)胞增殖毒性。并對絲素肽進(jìn)行反相高效液相色譜分析，分析抑菌成分的保留時間，對以后的研究奠定一定基礎(chǔ)。同時本研究也為今后絲素肽的生產(chǎn)應(yīng)用，例如食品添加劑、功能性食品、化妝品等的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。