趙二虎，張奎，蘇晶晶，潘光照，李重陽，申利，楊麗群，崔紅娟

1西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

2 重慶市蠶絲生物材料與再生醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，重慶 400716

3 西南大學(xué)腫瘤生物醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化工程研究中心，重慶 400715

4 威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，重慶 400039

整合素蛋白家族(Integrin family) 是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的黏附分子受體，是由α和β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白[1-2]。整合素(或稱整合蛋白) 參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM) 之間以及細(xì)胞與病原體之間的相互作用，是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中間橋梁，廣泛參與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲和細(xì)胞衰老等一系列生理或病理過程[2-9]。目前在哺乳動(dòng)物的整合素家族中，已發(fā)現(xiàn)有18種α亞基和8種β亞基，能組成至少24種功能性的二聚體跨膜蛋白[10-12]；果蠅的整合素家族則有5個(gè)α亞基，分別為αPS1(編碼mew 基因)、αPS2(編碼 if 基因)、αPS3(編碼scb基因)、αPS4和 αPS5；2個(gè) β亞基，分別為βPS(編碼 mys基因) 和 βv[13-14]；果蠅整合素基因與果蠅的胚胎發(fā)育、肌肉收縮、腸道的形態(tài)發(fā)生以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間交流都有重要的作用[15-16]。

在鱗翅目昆蟲大豆尺夜蛾P(guān)seudoplusiaincludens和煙草天蛾Manduca sexta中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少3個(gè)α亞基和1個(gè)β亞基，其整合素與昆蟲免疫反應(yīng)相關(guān)，主要是參與病原的吞噬、形成結(jié)節(jié)和包被等[12,17-19]。而鱗翅目害蟲甜菜夜蛾Spodoptera exigua和煙夜蛾Helicoverpa assulta的整合素Integrin β相關(guān)基因已經(jīng)被鑒定，并分別命名為SeINT和HaITGb1，其功能不僅與昆蟲細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)有關(guān)，還參與了其幼蟲的生長發(fā)育[12,20]；此外，SeINT基因還對(duì)昆蟲中腸的消化和吸收有著重要作用[21]。Zhang等和孫亞蘭對(duì)家蠶整合素BmIntegrin基因家族進(jìn)行了初步的描述和鑒定，研究結(jié)果顯示家蠶整合素蛋白擁有6個(gè)α亞基和5個(gè)β亞基[22-23]。盡管如此，有關(guān)家蠶整合素的結(jié)構(gòu)功能只有少量報(bào)道[22]，而對(duì)于家蠶整合素β亞基蛋白的研究更是少之又少。因此，筆者采用生物信息學(xué)分析及RACE技術(shù)，克隆并鑒定BmIntegrin β2基因，嘗試構(gòu)建 BmIntegrin β2蛋白原核表達(dá)載體，表達(dá)靶標(biāo)蛋白，制備多克隆抗體，并分析其在家蠶血液免疫中的功能，為進(jìn)一步研究家蠶整合素β亞基蛋白家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究主要采用中國本地家蠶品種大造作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由西南大學(xué)家蠶基因資源庫提供。質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國 Qiagen公司。感受態(tài)細(xì)胞由TaKaRa的感受態(tài)制備試劑盒制備。各種限制性內(nèi)切酶、PCR酶、T4 DNA連接酶、載體質(zhì)粒和DNA Marker等均購自大連TaKaRa公司。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Promega公司。SMARTer RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒購自美國Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成

選取4齡3天和5齡3天的家蠶幼蟲，解剖獲得家蠶體壁組織、馬氏管、頭部、絲腺組織、精巢、卵巢、脂肪體、中腸組織、血細(xì)胞、翅原基等組織，在液氮中研碎，然后加入TRIzol試劑，并提取各組織的總RNA；然后按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法步驟反轉(zhuǎn)錄合成各組織的cDNA。

1.2.2 BmIntegrin β2基因全長序列的獲取

根據(jù)之前的文獻(xiàn)報(bào)道[24-25]，設(shè)計(jì)基因特異RACE引物 GSP1、NGSP1、GSP2、NGSP2(引物序列見表1)。根據(jù)RACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒的說明書，進(jìn)行5′和3′的RACE cDNA擴(kuò)增。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收進(jìn)行克隆和轉(zhuǎn)化，然后篩選出陽性克隆。最后，將陽性克隆送至生工生物工程(上海) 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，分析拼接后得到目的基因的cDNA全長序列。

1.2.3 BmIntegrin β2的生物信息學(xué)分析

相關(guān)基因的序列均來自于NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 或家蠶基因組數(shù)據(jù)庫SilkDB(http://www.silkdb.org)，并利用在線軟件SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)、NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 等網(wǎng)站及 GeneDoc和Adobe Illustrator CS6等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析及作圖。

1.2.4 BmIntegrin β2基因的定量表達(dá)分析

基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，設(shè)計(jì)和合成BmIntegrin β2的熒光定量 PCR引物(表 1)，以前期獲得的4齡3天和5齡3天的家蠶幼蟲各組織cDNA為模板，以家蠶細(xì)胞甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增分析。每個(gè)組織樣品分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，收集目的基因和內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析；以家蠶血細(xì)胞中BmIntegrinβ2的表達(dá)量為對(duì)照，利用 2–ΔΔCt方法計(jì)算和分析其他組織中BmIntegrin β2的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 BmIntegrin β2蛋白的原核表達(dá)純化與抗體制備

通過對(duì)基因的生物學(xué)分析，選取家蠶整合素BmIntegrin β2基因的特異性片段，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pET32a空載體中，獲得pET32a-BmIntegrin β2質(zhì)粒。篩選獲得陽性克隆質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosseta 菌株中，挑取陽性的 pET32a-BmIntegrin β2/Rosetta單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]中的方法，向菌液中加入1 mmol/L的IPTG，分別在16 ℃、25 ℃和37 ℃的條件下，以300 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行菌液培養(yǎng)，其中 37 ℃組培養(yǎng) 5 h，25 ℃組培養(yǎng) 12 h，16 ℃組培養(yǎng)24 h。裂解誘導(dǎo)好的菌液，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，并用考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行拍照分析。

通過大量誘導(dǎo)pET32a-BmIntegrin β2/Rosetta菌表達(dá)目的蛋白，按照文獻(xiàn)[27]所用的Triton X-100法提取和洗滌包涵體蛋白，然后用鎳離子親和柱進(jìn)行純化，并用含有相應(yīng)濃度的咪唑平衡液洗脫目的蛋白；收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)分析蛋白純化的情況。然后選取純度高于85%的蛋白樣品送至重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，制備多克隆抗體。

1.2.6 BmIntegrin β2抗體的效價(jià)及其對(duì)家蠶血細(xì)胞的影響

采用間接ELISA法對(duì)所獲得抗BmIntegrin β2血清，進(jìn)行抗體效價(jià)的檢測(cè)。第一步，首先在96孔酶標(biāo)板中加入100 μL的抗原濃度為2 μg/L的包被液，密封置于 2–8 ℃環(huán)境過夜；將包被好的酶標(biāo)板取出揭開，并去除上清液，再用洗滌液洗3次。第二步，按照上面的類似的步驟再用封閉液37 ℃封閉1 h，并用洗滌液洗3次。第三步，將相應(yīng)的抗體分別以1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000和1∶256 000等比例分別稀釋后，再各取100 μL加入封閉后的酶標(biāo)板，置于37 ℃環(huán)境孵育1 h，并用洗滌液洗3次；以未稀釋的陰性血清作陰性對(duì)照，以相應(yīng)的陰性血清稀釋液作空白對(duì)照。第四步，用稀釋液以1∶30 000比例稀釋酶標(biāo)二抗，然后每孔各加100 μL的酶標(biāo)二抗稀釋液，將酶標(biāo)板置于37 ℃環(huán)境孵育1 h，并用洗滌液洗 3次。第五步，按照 TMB顯色試劑盒的步驟進(jìn)行顯色，并測(cè)定出450 nm處的OD值。第六步，按照以上步驟將所獲得的抗體在1周內(nèi)反復(fù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，利用SPSS 19.0等軟件計(jì)算和分析出OD值結(jié)果的變異系數(shù)。

參照之前文獻(xiàn)[28]的方法，先將抗體制備成5、10、20和100倍稀釋液；然后從5齡3天幼蟲的足部收集家蠶血細(xì)胞，將血細(xì)胞加入已配制好的梯度抗體稀釋液中，約 106個(gè)/mL，置于 4 ℃環(huán)境輕搖30 min。將孵育好的細(xì)胞滴入24孔板中，25 ℃培養(yǎng)30 min。最后用4%多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌后置于顯微鏡下觀察和拍照，統(tǒng)計(jì)分析漿細(xì)胞的數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶整合素BmIntegrin β2基因的克隆與分析

通過前期生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的結(jié)果，結(jié)合PCR技術(shù)，克隆了家蠶整合素BmIntegrin β2基因的部分cDNA序列，約為1 700 bp(圖1A)；以已知的部分 cDNA序列為模板，利用 RACE技術(shù)對(duì)該基因的5′端和3′端進(jìn)行擴(kuò)增，并分別獲得了 5′ RACE和3′ RACE的PCR片段產(chǎn)物(圖1A)。家蠶整合素BmIntegrin β2基因在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中被編號(hào)為BGIBMGA006002，定位于家蠶4號(hào)染色體，基因全長為6 311 bp，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成(圖1B)。家蠶BmIntegrin β2基因的cDNA全長2 434 bp，其中開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF) 的長度為 2 244 bp，5′端和3′端非編碼區(qū)分別為118 bp和72 bp(圖1C)。

圖1 家蠶BmIntegrin β2全長克隆及信息分析Fig.1 Cloning and bioinformatics of BmIntegrin β2 in Bombyx mori.(A) Full-length cDNA was cloned by RACE method.M: marker; 1: PCR product of partial fragment; 2: 5′ RACE PCR product; 3: 3′ RACE PCR product.(B)The diagram of BmIntegrin β2 complete genomic sequence.(C) The diagram of BmIntegrin β2 complete cDNA sequence.

2.2 家蠶整合素BmIntegrin β2的結(jié)構(gòu)分析

家蠶整合素BmIntegrin β2蛋白包含747個(gè)氨基酸(Amino acid，aa)，預(yù)測(cè)蛋白分子量為84.42 kDa，等電點(diǎn)為 5.349。利用 SMART和SignalP等生物信息學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)在該蛋白的前 19個(gè)氨基酸組成一段信號(hào)肽區(qū)域，第28–435位氨基酸區(qū)域?yàn)镮NB結(jié)構(gòu)域(Integrin beta subunits domain，INB)，第 133–137位氨基酸區(qū)域?yàn)镸IDAS金屬離子結(jié)合序列(Metal ion-adhesion motif，MIDAS)，第 460–502位氨基酸區(qū)域和第507–534位氨基酸區(qū)域構(gòu)成了EGF結(jié)構(gòu)域(Epithelial growth factor domain，EGF)，第 678–700 位氨基酸區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)域(Transmembrane domain，TM)，第 701–746位氨基酸區(qū)域?yàn)檩^短的胞內(nèi)域(Cytoplasmic domain，CD)(圖 2A)。總之，家蠶整合素 BmIntegrin β2預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)主要包括信號(hào)肽、一段較大的胞外域(Extracellular domain，ED)，單次跨膜結(jié)構(gòu)和較短的胞內(nèi)域(圖2B)。

2.3 家蠶整合素BmIntegrin β2的表達(dá)分析

對(duì)4齡3天的家蠶幼蟲各組織BmIntegrin β2基因的mRNA水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示BmIntegrin β2在家蠶血液細(xì)胞和翅原基中高度表達(dá)，在頭部、馬氏管和中腸組織中則有少量的表達(dá)，而在其他組織中幾乎不表達(dá)(圖3A)。同樣的，在5齡3天的家蠶幼蟲中，BmIntegrin β2在家蠶血液細(xì)胞和翅原基中依舊高度表達(dá)(圖3B)。由于翅原基中包含家蠶的造血器官，因此我們推測(cè)BmIntegrin β2基因在家蠶血液細(xì)胞中可能發(fā)揮著重要的作用。

2.4 BmIntegrin β2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及抗體制備

首先構(gòu)建好帶有BmIntegrin β2片段(圖4A)的 pET32a-Integrin β2重組質(zhì)粒(圖 4B)，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中；然后在帶有pET32a-Integrin β2重組質(zhì)粒的大腸桿菌中加入 1 mmol/L的IPTG，并分別在16 ℃、25 ℃和37 ℃條件下進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。然后利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示無論是16 ℃、25 ℃或37 ℃條件下誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間，細(xì)胞裂解后上清液中幾乎沒有檢測(cè)到目的蛋白(圖 4C，泳道 3、5和 7)，而在所有的沉淀中都檢測(cè)到了約 48 kDa的目的蛋白(圖 4C，泳道 4、6和 8)；與其他條件相比，在 37 ℃下目的蛋白表達(dá)量更高，這說明此條件下，Integrin更容易形成包涵體。因此，我們選擇在37 ℃條件下，加入1 mmol/L的IPTG進(jìn)行大規(guī)模表達(dá) Integrin蛋白。大規(guī)模誘導(dǎo)蛋白后，通過Ni2+離子親和層析法，得到純度超過95%的家蠶整合素 Integrin β2 蛋白(圖 4D)。

圖2 家蠶整合素BmIntegrin β2的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Protein structure prediction from BmIntegrin β2 sequence.(A) Nucleotide(above) and deduced amino acid sequences(below) of BmIntegrin β2 in silkworm,Bombyx mori.Pink box: siganl Peptide; gray box: integrin beta subunits domain,INB domain; red underline: antigenic peptide fragments of BmIntegrin β2; green box: epithelial growth factor domain,EGF domain; blue box: transmembrane domain; Purple box: cytoplasmic domain; yellow Wireframe: metal ion-adhesion motif,MIDAS motif; red Wireframe: polyadenylation signal.The start codon and stop codon are marked red.(B) Conserved domains of BmIntegrin β2 in silkworm,Bombyx mori.SP: signal peptide; ED:N-terminal portion of extracellular region; TM: transmembrane segment; CD: cytoplasmic domain.

圖3 家蠶整合素BmIntegrin β2在家蠶幼蟲時(shí)期的各組織表達(dá)圖譜Fig.3 Expression of BmIntegrin β2 mRNA in the different tissues.(A) The expression of BmIntegrin β2 mRNA in the different tissues of the 3rd day of 4th larvae.(B) The expression of BmIntegrin β2 mRNA in the different tissues of 3rd day of 5th larvae.1: hemocyte; 2: wing disc; 3: head; 4: epidermis; 5: fat body; 6: malpighian tubules; 7: silk gland; 8:midgut; 9: testis; 10: ovary.

圖4 BmIntegrin β2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化Fig.4 Induction and purification of recombinant protein BmIntegrin β2.(A) Protein structure prediction from BmIntegrin β2.Red Wireframe: the antibody fragment.(B) The construction of the pET32a-Integrin β2 plasmid.M:DNA marker; 1: the PCR product of antibody fragment sequence; 2–3: the plasmid/Dual restriction enzyme digestion analysis of pMD19-BmIntegrin β2; 4: extraction of PCR product; 5: pET32a vector; 6–7: the plasmid/Dual restriction enzyme digestion analysis of pET32a-Integrin β2; 8–9: single restriction enzyme digestion analysis of pET32a vector/pET32a-Integrin β2.(C) Induction of the BmIntegrin β2 protein in E.coli.M: protein marker; 1–2: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 0 mmol/L IPTG at 16 ℃ for 24 h; 3–4: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 16 ℃ for 24 h; 5–6: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 12 h; 7–8: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 5 h.(D) Purified BmIntegrin β2 protein.M: protein marker; 1–2: the soluble fraction/inclusion body of recombinant E.coli by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 5 h; 3: the soluble fraction before/after purification.

2.5 BmIntegrin β2的抗體效價(jià)及其對(duì)家蠶血細(xì)胞的調(diào)控作用

我們所設(shè)計(jì)的BmIntegrin β2重組蛋白抗原片段的氨基酸序列總長為 235個(gè)氨基酸(圖 2A和4A)；具體為 BmIntegrin β2 蛋白的第 20–254 位氨基酸，其中包括完整的 MIDAS金屬離子結(jié)合序列和部分的INB結(jié)構(gòu)域(圖2A和4A)。我們采用間接ELISA法，對(duì)所獲得的BmIntegrin β2抗體進(jìn)行了抗體效價(jià)的檢測(cè)，結(jié)果顯示BmIntegrin β2抗體效價(jià)高達(dá) 1∶128 000(表 2)，這說明所獲得 BmIntegrin β2抗體具有較高的抗體效價(jià)。另外，所有稀釋度的樣品的變異系數(shù)在 0.929%–8.166%之間(表 2)，這也說明所獲得BmIntegrin β2抗體的重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好。因此，BmIntegrin β2抗體可為后續(xù)研究BmIntegrin β2蛋白功能提供抗體支持。

為了研究BmIntegrinβ2蛋白在家蠶血液免疫中的作用，我們通過采集家蠶的血液，在體外用稀釋5倍后的抗BmIntegrin β2血清對(duì)家蠶的循環(huán)血細(xì)胞進(jìn)行孵育，如圖5A所示，經(jīng)抗BmIntegrin β2血清孵育過的循環(huán)血細(xì)胞中漿細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，這從側(cè)面說明BmIntegrin β2抗體可能抑制了漿細(xì)胞的延伸性和粘附能力。為了證實(shí)這一結(jié)果，我們將抗BmIntegrin β2血清進(jìn)行5–100倍的稀釋后繼續(xù)檢測(cè)其對(duì)漿細(xì)胞數(shù)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗體濃度的逐步提高，漿細(xì)胞的數(shù)量越來越少，呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴效應(yīng)。這也進(jìn)一步表明BmIntegrin β2可能參與對(duì)漿細(xì)胞的延伸性和粘附能力的調(diào)控，進(jìn)而影響到家蠶血液的免疫反應(yīng)。

表2 家蠶整合素BmIntegrin β2抗血清的效價(jià)檢測(cè)Table 2 Titer curve of anti-BmIntegrin β2 serum

圖5 BmIntegrin β2抗體對(duì)漿細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.5 Effect of anti-BmIntegrin β2 serum on the plasmatocytes number.(A) The analysis of the plasmatocytes number after treated by pre-immune serum and anti-BmIntegrin β2 serum.Anti-BmIntegrin β2 serum was diluted to 5-Fold and cells marked with “ * ” are plasmatocytes.(B) Effects of gradient dilution anti-BmIntegrin β2 serum on the number of plasmatocytes.Data represent the ±s of at least three independent experiments.Statistical analysis was performed using the 2-tailed Student’s t-test,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

昆蟲的血液系統(tǒng)為開放式循環(huán)系統(tǒng)，體腔內(nèi)的所有組織器官均浸浴其中，昆蟲的血液系統(tǒng)不僅具有運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的能力，還具有細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的功能。因此，昆蟲血細(xì)胞在先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，如吞噬作用、包囊作用、結(jié)節(jié)作用、黑化反應(yīng)和抗菌肽分泌等[23,29]。傳統(tǒng)的昆蟲血細(xì)胞分類方法，主要是根據(jù)組織化學(xué)染色、細(xì)胞形態(tài)和功能特征等對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，據(jù)此家蠶血細(xì)胞可分為 5種類型，即原血細(xì)胞(Prohemocyte)、顆粒細(xì)胞(Granulocytes)、漿細(xì)胞(Plasmatocytes)、擬絳色細(xì)胞(Oenocytoids) 和小球細(xì)胞(Spherulocytes)[30-32]。在家蠶的血細(xì)胞類型中，顆粒細(xì)胞和漿細(xì)胞是執(zhí)行細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要血細(xì)胞類型，其中家蠶漿細(xì)胞體積相對(duì)較大，均大于其他類型的血細(xì)胞，僅稍小于擬絳色細(xì)胞，但擬絳色細(xì)胞沒有粘附能力；此外漿細(xì)胞還擁有非對(duì)稱性偽足(Pseudopod)，這也是漿細(xì)胞區(qū)別其他類型血細(xì)胞的主要特征之一[30-31,33]。漿細(xì)胞主要參與家蠶血液免疫中的包囊反應(yīng)，其可通過伸出非對(duì)稱性偽足快速粘附到外源入侵物或創(chuàng)傷的表面進(jìn)行免疫反應(yīng)[33]。

整合素是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的黏附分子受體，是由α和β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白[1-2]。整合素參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM) 之間以及細(xì)胞與病原體之間的相互作用，其是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中間橋梁，廣泛參與細(xì)胞識(shí)別，細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲和細(xì)胞衰老等一系列生理或病理過程[2-9]。在鱗翅目昆蟲細(xì)胞內(nèi)，例如甜菜夜蛾Spodoptera exigua和煙夜蛾Helicoverpa assulta等，整合素主要表達(dá)于血細(xì)胞，參與其細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)。有關(guān)家蠶整合素的功能作用的報(bào)道相對(duì)較少，我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)對(duì)家蠶整合素基因Integrin αPS3[25]和 Integrin β1[34]進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其均高表達(dá)于家蠶循環(huán)血液細(xì)胞，且都參與了家蠶血細(xì)胞執(zhí)行的免疫反應(yīng)過程。本研究中的 BmIntegrin β2蛋白，同樣地屬于跨膜糖蛋白整合素家族，也高表達(dá)于家蠶循環(huán)血液細(xì)胞。我們通過BmIntegrin β2蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其蛋白結(jié)構(gòu)中胞外域占據(jù)了很大的部分，因而采用胞外域氨基酸的序列來制備BmIntegrin β2抗體。根據(jù)最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，我們推測(cè)BmIntegrin β2抗體可能通過與BmIntegrin β2蛋白胞外域部分結(jié)合，競(jìng)爭性地抑制了其與整合素配體的結(jié)合，從而阻斷整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的橋梁作用，最終抑制了漿細(xì)胞的延伸性和粘附作用。目前家蠶整合素BmIntegrin β2在家蠶血液細(xì)胞免疫反應(yīng)中具體的作用機(jī)制還不清楚，但本研究獲得的純化的BmIntegrin β2抗體及所發(fā)現(xiàn)其對(duì)漿細(xì)胞粘附能力的影響，為進(jìn)一步研究BmIntegrin β2在昆蟲細(xì)胞中的功能作用奠定了基礎(chǔ)，并提供了一個(gè)新的研究視野。