趙春霖，金莉莉，邰思佳，張學(xué)敏，史天聰，吳飛，王秋雨

遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036

創(chuàng)面感染常貫穿燒傷、燙傷患者治療的全過程，目前臨床上的抗生素治療常引發(fā)耐藥菌感染及二重感染，而后者是燒燙傷后繼發(fā)敗血癥及膿血癥的主要原因[1]。

抗菌肽是一類由20–60個氨基酸殘基組成的堿性多肽，分子量在2 000–7 000 Da左右，具有廣譜抗菌活性，其獨特的抗菌機制使細(xì)菌不易對其產(chǎn)生耐藥性。近期研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)抗菌肽還具有選擇性免疫激活特性和調(diào)節(jié)功能，對敗血癥有良好的預(yù)防和治療作用，這使抗菌肽有望成為潛在的抗菌治療藥物[2-3]。此外，重組DNA技術(shù)的日益成熟，也使抗菌肽的大量生產(chǎn)成為可能[4]。

抗菌肽AWRK6(SWVGKHGKKFGLKKHKKH)是對東北林蛙抗菌肽Dybowskin-2CDYa(SAVGRHS RRFGLRKHRKH，GenBank Accession No.ACF08009.1) 進行改造獲得具有性能更穩(wěn)定和抗菌活性更廣譜的新型肽[5-7]。人表皮生長因子(Human epidermal growth factor,hEGF) 屬于促生長因子家族成員之一，是上皮和間充質(zhì)等細(xì)胞的敏感細(xì)胞絲裂原，為促進細(xì)胞增殖分化最有力的細(xì)胞因子之一。hEGF重組蛋白已廣泛用于皮膚燒傷、燙傷、角膜損傷及胃潰瘍等方面且效果明顯[8]。我們在前期研究中克隆了長度為54 bp的AWRK6和153 bp的hEGF基因，中間由6個氨基酸構(gòu)成的連接肽連接而成，構(gòu)建了原核表達(dá)載體hEGF-AWRK6/pET-30a(+)，以期獲得具有促創(chuàng)面愈合及抗感染的雙功能融合肽hEGF-AWRK6(以下簡稱EK)，EK基因序列長度為225 bp。前期體外實驗表明，EK具有抗大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌等廣譜抗菌活性及顯著地促成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖和遷移的作用[9]。

本研究中，我們純化了重組表達(dá)的EK，并構(gòu)建了Ⅱ度燙傷感染小鼠模型， 并用EK對其施以干預(yù)治療，從而探索 EK對模型小鼠促創(chuàng)面愈合及抗創(chuàng)面感染中的功效，為其進一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有His-hEGF-AWRK6/pET-30a(+)的E.coli BL21(DE3)、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa臨床分離株均由本實驗室保存。TEV蛋白酶、BCA試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、Mouse Anti-His Tag單克隆抗體、hEGF和Ⅰ型膠原抗體購自 Sigma公司。AWRK6由吉爾生化(上海) 有限公司合成。燙傷膏為天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。其他試劑購自國藥化學(xué)試劑集團，均為分析純度。

1.2 實驗動物

昆明小白鼠，雄性，平均體重20 g/只，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.3 EK誘導(dǎo)表達(dá)

將含有His-hEGF-AWRK6/pET-30a(+)的E.coli BL21(DE3) 菌株經(jīng) 37 ℃振搖過夜復(fù)蘇，1∶20比例接種500 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)2.5 h至對數(shù)生長期。加入終濃度1 mmol/L異丙基-β-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-galactosidase，IPTG) 誘導(dǎo)4 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體。

1.4 包涵體蛋白復(fù)性及表達(dá)產(chǎn)物純化和Western blotting鑒定

菌體經(jīng)液氮反復(fù)凍融及超聲破碎，12 000 r/min離心10 min收集包涵體沉淀。包涵體沉淀于變性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L β-巰基乙醇/DTT，2 mmol/L 脫氧膽酸鈉，8 mol/L 尿素，pH 8.5) 中 4 ℃過夜溶解，12 000 r/min離心10 min收集上清，在梯度復(fù)性緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，6、4、2 mol/L尿素，1%甘氨酸，5%甘油，0.2% PEG，pH 8.5) 中，4 ℃緩慢透析 24–36 h，再在結(jié)合緩沖液中透析約6 h，確保融合蛋白穩(wěn)定可溶?？扇艿鞍撞捎肏is-Trap FF親和層析純化，以含 500 mmol/L咪唑的洗脫液(50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)，150 mmol/L NaCl) 洗脫，收集液使用BCA試劑盒法測定蛋白濃度，并利用12%SDS-PAGE檢測純度，透析脫鹽。使用抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體進行Western blotting實驗，鑒定重組EK6的表達(dá)。

1.5 EK的His標(biāo)簽去除及活性檢測

按TEV蛋白酶使用說明書進行操作，反應(yīng)體系：0.1 mg EK、10 μL 10×酶切緩沖液(500 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，1% Tween-20，10 mmol/L DTT，pH 8.0)、20 U TEV蛋白酶，總反應(yīng)體積100 μL，4 ℃過夜，酶切去除His標(biāo)簽。酶切結(jié)束后進行二次His-Trap FF親和層析，收集洗脫液，透析除鹽、凍干，獲得融合多肽EK干粉。以0.1 mol/L PBS作為陰性對照組，利用牛津杯法檢測不同濃度EK(10、20、30 mg/L) 對銅綠假單胞菌的抑菌活性。

1.6 燙傷感染模型建立及給藥方式

昆明小鼠經(jīng)10%水和氯醛腹腔麻醉，8%硫化鈉背部脫毛，常規(guī)消毒。采用自制水浴燙傷板，沸水停留10 s，在背部腰椎正中的左右兩側(cè)燙取直徑 0.85 cm圓形創(chuàng)面各一個(皮膚病理切片證實為Ⅱ度燙傷)[10]，兩相鄰創(chuàng)面相距 1 cm。創(chuàng)面涂抹綠膿桿菌0.05 mL(1×108CFU/mL)。燙傷模型小鼠隨機分4組，每組12只。于傷后2 h在實驗組創(chuàng)面均勻滴注0.05 mL的EK(30 mg/L)，對照組分別滴注 0.05 mL 的 PBS、hEGF(100 μg/L)、燙傷膏(10 mg/L)，作用 5 min后用滅菌紗布包扎，每日給藥一次至傷后第10天。相關(guān)藥品所用劑量參考使用說明和前期預(yù)實驗研究結(jié)果。

1.7 EK的創(chuàng)面抑菌功能及促燙傷愈合功能檢測

創(chuàng)面抑菌功能測定：分別于傷后3、6、10 d處死小鼠，每組取3只。無菌條件下剪取創(chuàng)面表層組織1 g左右，稱重并加入等滲鹽水l mL，勻漿。倍比稀釋后接種在 LB固體瓊脂平板上，置于37 ℃溫箱中孵育24 h。計數(shù)平板菌落數(shù)并計算每克組織的克隆形成單位(CFU)。

含菌量(CFU/g) = 平皿菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷10 μL/組織重量(g)。

創(chuàng)面愈合檢測：于燙傷第1天開始，每天記錄小鼠創(chuàng)傷面的面積。每組取平均值，以每組平均面積的減小程度來反映創(chuàng)面面積愈合情況，計算創(chuàng)面愈合率。

創(chuàng)面愈合率(%)＝(原始創(chuàng)面面積–未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積。

創(chuàng)面的組織結(jié)構(gòu)觀察：取給藥10 d小鼠創(chuàng)面皮膚組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后制備常規(guī)病理切片，蘇木素-伊紅(HE) 染色，光鏡觀察皮膚的病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

EK對燙傷皮膚Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響：提取于傷后2、4、6、8、10 dEK組小鼠燙傷處皮膚總蛋白，取40 μg總蛋白進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至NC膜，經(jīng)過BSA封閉、一抗二抗孵育、ECL發(fā)光后曝光，Western blotting檢測Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，也利用同種方式檢測傷后第10天4組小鼠的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，結(jié)果利用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)EK的分離純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，His-hEGF-AWRK6/pET-30a(+)轉(zhuǎn)化的E.coil BL21菌株包涵體在分子量約為14.3 kDa附近具有特異蛋白條帶，與預(yù)期的分子量相符，而空白菌株、誘導(dǎo)的pET-30a(+)轉(zhuǎn)化菌株、及未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌無相應(yīng)的蛋白條帶(圖1A)。復(fù)性后的目的蛋白經(jīng) Histrap FF 鎳離子螯合親和層析，獲得單一條帶的目的蛋白(圖 1B)。此結(jié)果說明融合多肽在大腸桿菌BL21(DE3) 中成功表達(dá)，純化效果良好。

2.2 重組表達(dá)EK的鑒定及活性檢測

利用抗His標(biāo)簽的鼠單克隆抗體進行Western blotting分析，可見誘導(dǎo)的hEGF-AWRK6/pET-30a(+)轉(zhuǎn)化菌株具有重組蛋白 EK的表達(dá)，而未轉(zhuǎn)化的BL21(DE3) 中沒有特異蛋白檢出(圖2A)。去除His標(biāo)簽后抑菌實驗結(jié)果顯示，重組表達(dá)的EK對銅綠假單胞菌均具有顯著抑菌活性，且與濃度呈正相關(guān)(圖2B)。

2.3 重組表達(dá)EK對模型小鼠創(chuàng)面的抑菌功能

在給藥處理的第1天和第3天，EK組小鼠燙傷創(chuàng)面綠膿桿菌菌落數(shù)雖有減少，但與PBS對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在給藥第6天和第10天，EK組小鼠創(chuàng)面菌落數(shù)顯著降低，與PBS對照組差異極顯著(P＜0.01)，但與燙傷膏組小鼠創(chuàng)面菌落數(shù)無顯著差異(P＞0.05)(圖 3)。

2.4 重組表達(dá)EK對傷口愈合的影響

由圖 4可見，各組小鼠初始創(chuàng)面直徑為(0.85±0.02) cm，隨著時間推移，各組創(chuàng)面逐漸縮小，但于第6天開始，EK組小鼠創(chuàng)面愈合加快，至第10天時，EK組小鼠創(chuàng)面直徑顯著小于PBS組(P＜0.01)，結(jié)果顯示 EK可以促進小鼠皮膚創(chuàng)面愈合，縮短愈合時間。

圖1 融合多肽EK的誘導(dǎo)表達(dá)及純化Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression and purification of fusion polypeptide EK.(A) SDS-PAGE analysis of EK.1:vacuolar BL21(DE3); 2: uninduced pET-30a(+) transformed strain; 3: induced pET-30a(+) transformed strain; 4:uninduced hEGF-AWRK6/pET-30a(+) transformed strain; 5: induced hEGF-AWRK6/pET-30a(+) transformed strain.M:premixed protein marker.(B) Purified results of EK by SDS-PAGE.1: purified target protein; M: premixed protein marker.

圖2 重組表達(dá)蛋白EK的Western blotting鑒定及抑菌活性Fig.2 Identification of EK by Western blotting and activity detection of recombinant expressed EK.(A) Identification of recombinant expression EK by Western blotting.1–4: induction 1–4 h of hEGF-AWRK6/pET-30a(+) bacteria; 5:normal bacteria.(B) Bacteriostasis of EK on Pseudomonas aeruginosa.1: PBS(0.1 mol/L); 2: EK(10 mg/L); 3: EK(20 mg/L); 4: EK(30 mg/L).(C) The dose-response curve of EK’s antibacterial effect.

圖3 hEGF-AWRK6對模型小鼠燙傷皮膚細(xì)菌數(shù)量的影響(×106 CFU/g)Fig.3 Effect of hEGF-AWRK6 on burned skin bacterial count of model mice(×106 CFU/g).

圖4 hEGF-AWRK6對模型小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響(n=12)Fig.4 Effect of hEGF-AWRK6 on skin wound healing in model mice(n=12).

2.5 重組表達(dá)EK對燙傷皮膚的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

對燙傷小鼠給藥處理后的第 10天組織切片結(jié)構(gòu)顯示，EK組小鼠創(chuàng)面表皮較薄，毛囊生長較多，有部分角質(zhì)上皮，真皮層細(xì)胞排列規(guī)則，而PBS組小鼠創(chuàng)面表皮與真皮脫離，無毛囊生長(圖5 A)。小鼠在燙傷后第 10天燙傷處皮膚進行Ⅰ型膠原蛋白的Western blotting檢測(圖5B)，與PBS對照組相比，Ⅰ型膠原蛋白在 EK組、燙傷膏組、hEGF組顯著表達(dá)(P＜0.01)。在給藥期間內(nèi)，EK 組的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量與給藥時間呈正相關(guān)(圖 5C)。此結(jié)果表明，融合多肽EK對小鼠皮膚創(chuàng)傷面修復(fù)過程具有促進作用且與促膠原蛋白表達(dá)相關(guān)。

圖5 給藥10 d后皮膚創(chuàng)面的組織學(xué)變化(10×10) 及Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)Fig.5 Histological changes of the skin wound after administration of 10 d and the expression of typeⅠcollagen.(A)Histological structure of the skin wound after administration of 10 d.1: PBS group; 2: hEGF group; 3: EK group; 4:burn ointment group.(B) TypeⅠcollagen expression analysis of Western blotting results in the tenth day.(C) TypeⅠcollagen expression analysis of Western blotting in 10 days.

3 討論

創(chuàng)面感染是臨床常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，其多數(shù)病原菌的耐藥性隨著抗生素的廣泛使用呈逐年上升趨勢[11]。陽離子抗菌肽可以結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)菌菌膜并使之裂解，此獨特的抗菌機制，使細(xì)菌不易對其產(chǎn)生抗藥性，因而被認(rèn)為是一類新型的抗菌藥物[12-14]。Daptomycin 等抗菌肽已應(yīng)用于生物醫(yī)藥及臨床治療等領(lǐng)域[15-17]。

AWRK6由18個氨基酸組成，是從東北林蛙皮膚提取并經(jīng)改良獲得的陽離子多肽，富含賴氨酸，具有廣譜抗菌活性和較好的穩(wěn)定性[7,18]。人表皮生長因子(hEGF) 是由 51個氨基酸組成的小分子多肽，在酸、堿、熱等環(huán)境下均較為穩(wěn)定，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，能刺激表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，因而創(chuàng)面愈合速率往往與hEGF的表達(dá)有關(guān)。hEGF己用于燒燙傷、潰瘍、各類創(chuàng)傷以及角膜損傷等的治療[8]。

研究表明，可以通過融合表達(dá)的方式減少抗菌肽對宿主細(xì)胞的毒性，降低純化過程的降解，從而增加表達(dá)量及活性[19]。因此，我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建AWRK6基因與hEGF基因的融合表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)后獲得了穩(wěn)定表達(dá)的融合肽EK。對其功能分析的結(jié)果顯示，EK具有抗出血性大腸桿菌O157、耐藥金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌的廣譜抗菌活性，并且能夠顯著促進上皮細(xì)胞增殖和成纖維細(xì)胞遷移[9]。

基于重組EK的上述功能，本文進一步對EK在促創(chuàng)面愈合和創(chuàng)面感染中的治療作用進行研究。銅綠假單胞菌為條件致病菌，在環(huán)境中廣泛分布且具有耐抗生素的特性[20]，是燒燙傷感染主要致病菌[21]。因此，我們創(chuàng)建了銅綠假單胞菌小鼠Ⅱ度燙傷感染模型，以 EK干預(yù)治療，對創(chuàng)面菌落、創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面組織學(xué)改變進行了研究。結(jié)果顯示，EK可明顯縮短小鼠燙傷后的創(chuàng)面愈合時間，于傷后第6–10天時，EK組小鼠創(chuàng)面愈合速率明顯高于PBS組小鼠(P＜0.01)。這與EK分子含有 hEGF功能結(jié)構(gòu)域有關(guān)。有報道表明，局部應(yīng)用EGF結(jié)合早期包扎治療能有效促進創(chuàng)面愈合[22]。hEGF可以與其特異的跨細(xì)胞膜表面的EGFR 結(jié)合，激活EGFR復(fù)合物中的酪氨酸激酶的活性，從而啟動特異基因的表達(dá)，介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與遷移活動，最終可導(dǎo)致迅速上皮化[23-25]。給藥處理第6天時，EK組小鼠創(chuàng)面菌落數(shù)顯著低于對照組(P＜0.01)，說明 EK可抑制創(chuàng)面細(xì)菌生長。實驗結(jié)果表明，重組表達(dá) EK治療組小鼠的創(chuàng)面愈合速率明顯高于單純使用 PBS組，這可能與 EK同時具有抗感染功能有關(guān)，從而加快傷口愈合速率(圖4)。

組織在創(chuàng)面修復(fù)過程中往往涉及細(xì)胞外基質(zhì)的形成，其主要成分是成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白，早期膠原表達(dá)在創(chuàng)面修復(fù)中起主要作用[26]。因此，我們分析了小鼠創(chuàng)面皮膚Ⅰ型膠原表達(dá)情況。結(jié)果顯示，EK干預(yù)組小鼠創(chuàng)面皮膚Ⅰ型膠原表達(dá)量隨時間上升；且與對照組相比，EK干預(yù)組小鼠傷后10 d時，創(chuàng)面皮膚Ⅰ型膠原表達(dá)顯著增加。這可能與 EK的組成成分有關(guān)，因為表皮生長因子具有加速上皮再生、促進膠原蛋白合成、刺激血管生成等作用[27]。膠原蛋白可構(gòu)成創(chuàng)面基質(zhì)，為基底細(xì)胞的增殖和移行奠定基礎(chǔ)，從而為創(chuàng)面上皮化提供支架，加快Ⅱ度燙傷小鼠創(chuàng)面的愈合。這一點在創(chuàng)面的組織學(xué)切片中也得到支持，組織學(xué)分析表明，EK可促小鼠燙傷處皮膚表皮細(xì)胞的生長發(fā)育，促進表皮毛囊的生長(圖5)。本研究還發(fā)現(xiàn)，EK組小鼠創(chuàng)面愈后沒有出現(xiàn)瘢痕形成，這與文獻(xiàn)報道一致，EGF可能通過抑制TGF-β1自體釋放而負(fù)調(diào)節(jié) TGF-β1的水平，而TGF-β1與愈合瘢痕形成有直接關(guān)系[28]。也有報道表明，創(chuàng)面快速上皮化會抑制成纖維細(xì)胞的過度增殖，促進膠原蛋白的規(guī)則排列，但其具體分子機制尚有待進一步研究[29]。

綜上所述，EK可促進Ⅱ度燙傷小鼠創(chuàng)面愈合，顯著縮短愈合所需時間，控制創(chuàng)面感染，具有開發(fā)成為治療感染型創(chuàng)傷藥物的潛能。