胡金飛，胡望遠(yuǎn)

(金華市中心醫(yī)院放療科，浙江 金華 321000)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，該病的發(fā)病原因至今尚未明確，可能與患者的遺傳、環(huán)境因素、心理情志因素等有關(guān)，近年發(fā)病率呈升高的趨勢，其死亡率占女性腫瘤的第二位，且呈低齡化發(fā)展[1]。據(jù)統(tǒng)計約10%的患者確診時已合并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(TNM分期 Ⅳ期)[2]，約30%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)患者生存期超過5年，10%的患者生存期超過10年[3]。針對已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者行原發(fā)病灶切除應(yīng)對遠(yuǎn)期療效具有積極影響，因此，本次研究入選的所有患者均進(jìn)行原發(fā)病灶的切除以期觀察預(yù)后情況。RNA解旋酶DDX3是DEAD box家族成員之一，參與mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，有研究報道其與多種惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等有關(guān)，有可能作為潛在的治療靶點[4]。目前關(guān)于DDX3與轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后關(guān)系研究尚未見報道，因此，本文研究RNA解旋酶DDX3在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的表達(dá)情況，為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

本次研究的患者為2010年1月至2012年6月期間就診金華市中心醫(yī)院確診為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的83例患者，年齡范圍35～74歲，平均年齡(51.25±2.41)歲，原發(fā)病灶經(jīng)穿刺活檢及病理組織切片檢測確認(rèn)，轉(zhuǎn)移病灶經(jīng)計算機(jī)斷層掃描(computed tomography, CT)、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)、放射性核素掃描確認(rèn)。所有患者書面簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過后開展本次研究。入選標(biāo)準(zhǔn)：初次就診經(jīng)穿刺活檢及病理組織切片檢測確認(rèn)為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，術(shù)前未進(jìn)行過放化療，預(yù)計生存期3個月以上，具備完整的病例和臨床資料包括隨訪資料完整，無其他嚴(yán)重臟器功能及慢性疾病，血液學(xué)檢查各項指標(biāo)基本正常，東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)評分≤3分。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者，顱腦轉(zhuǎn)移者，術(shù)前進(jìn)行過放化療者，妊娠或精神病史者，哺乳期婦女，生存期預(yù)計3月以內(nèi)者，臨床資料和隨訪資料不完整者，不配合完整治療者，合并有其他惡性腫瘤及慢性疾病者。

1.2 治療方法

入選的83例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，均進(jìn)行原發(fā)病灶組織切除，術(shù)后19例患者僅進(jìn)行放療，其余64例患者均進(jìn)行相應(yīng)個體化放療+化療。所有入選的患者均采用電話或門診隨訪的方式，截止日期為2017年7月31日，平均隨訪時間為(47.3±2.7)個月，隨訪內(nèi)容主要為患者術(shù)后3年的復(fù)發(fā)情況、生活情況等。

1.3 試驗方法

采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法檢測RNA解旋酶DDX3的表達(dá)，具體方法為：于術(shù)中取83例患者的癌組織和癌旁組織各30mg，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后供檢測使用，檢測時經(jīng)液氮吹打成粉末狀，加Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)分光光度計測總RNA后行逆轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime-ScriptTM，美國)說明書進(jìn)行，經(jīng)30℃10min、55℃35min反應(yīng)后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件為：1.5μL濃度為25mmol/L的MgCl2，2μL濃度為2.5mmol/L的dNTP，各1.25μL的PCR引物，2μL的DNA模板，0.5μL Tag DNA合成酶、2.5μL的10倍緩沖液，其余均用雙蒸水加至25μL，先于95℃預(yù)變性3min，再94℃變性30s，55℃退火37s，72℃延伸30s，共33個循環(huán)，最后72℃延伸3min。DDX3的表達(dá)量采用2表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 RNA解旋酶DDX3在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

通過RT-PCR檢測結(jié)果顯示，RNA解旋酶DDX3在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)(0.49±0.06)顯著高于癌旁組織的表達(dá)量(0.23±0.02)(P<0.05)。同時，RNA解旋酶DDX3在轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移部位數(shù)、雌激素受體/孕激素受體(estrogen receptor/progesterone receptor，ER/PR)狀態(tài)臨床因素中表達(dá)存在明顯差異(均P<0.05)，而在年齡、是否絕經(jīng)、癌組織類型臨床因素中不存在明顯差異(均P>0.05)，見圖1和表1。

圖1 RNA解旋酶DDX3在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

Fig.1 Expression of RNA helicase DDX3 in metastatic breast cancer tissues and adjacent tissues

因素例數(shù)(n)DDX3表達(dá)量t/FP年齡(歲)1.4320.149 <50310.49±0.04 ≥50520.43±0.04是否絕經(jīng)0.9140.206 是630.49±0.06 否200.47±0.03癌組織類型1.1070.163 浸潤性導(dǎo)管癌450.50±0.04 浸潤性小葉癌270.49±0.03 其他110.49±0.02轉(zhuǎn)移部位8.0130.003 軟組織170.40±0.03 淋巴結(jié)230.54±0.04 內(nèi)臟轉(zhuǎn)移210.39±0.03 骨轉(zhuǎn)移220.37±0.03轉(zhuǎn)移部位數(shù)9.2270.001 1～2510.37±0.04 ≥3320.52±0.04ER/PR狀態(tài)8.2460.002 陰性340.39±0.03 陽性490.52±0.04

2.2 DDX3的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

DDX3的表達(dá)水平≥0.45在術(shù)后3年的復(fù)發(fā)率明顯高于其表達(dá)水平<0.45者(P<0.05)。同時，DDX3的表達(dá)水平≥0.45者的平均復(fù)發(fā)時間也短于其表達(dá)水平<0.45者，兩組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 ROC曲線分析DDX3的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者復(fù)發(fā)診斷的預(yù)測價值

根據(jù)ROC曲線分析得到：RNA解旋酶DDX3的表達(dá)對轉(zhuǎn)移性乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)診斷的曲線下面積AUC為0.813(95%CI:0.702～0.906)，靈敏度為0.787，特異度為0.869，具體見圖2。

圖2 ROC曲線分析DDX3的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者復(fù)發(fā)診斷的預(yù)測價值研究

Fig.2 Predictive value of DDX3 expression on recurrence of metastatic breast cancer analyzed by ROC curve

2.4轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床病理資料與生存率關(guān)系的單因素分析

轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者術(shù)后3年、5年的生存率分別為45.85%、25.37%，將患者臨床資料與生存率進(jìn)行單因素分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移部位數(shù)、術(shù)后輔助放化療、DDX3表達(dá)量是影響患者3年、5年生存率的影響因素(P<0.05)，具體見表3、圖3。

Table 2 The relationship between DDX3 expression level and recurrence rate and recurrence time of metastatic breast cancer

表3 轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者臨床病理資料與生存率關(guān)系的單因素分析[n(%)]

(轉(zhuǎn)下表)

(續(xù)上表)

因素例數(shù)(n) 3年生存情況(n=38) 5年生存情況(n=21) 生存率χ2P生存率χ2P癌組織類型1.2180.1161.1030.205 浸潤性導(dǎo)管癌4520(44.44)15(33.33) 浸潤性小葉癌2712(44.44)5(18.52) 其他116(54.55)1(9.09)轉(zhuǎn)移部位8.4330.0049.2160.002 軟組織177(41.17)2(11.76) 淋巴結(jié)2311(47.83)9(39.13) 內(nèi)臟轉(zhuǎn)移2113(61.90)8(38.09) 骨轉(zhuǎn)移227(31.82)2(9.09)轉(zhuǎn)移部位數(shù)5.8730.0255.7970.028 1～25127(52.94)18(35.29) ≥33211(34.38)3(9.38)ER/PR狀態(tài)3.1120.0652.5320.074 陰性3418(52.94)11(32.35) 陽性4920(40.82)10(20.41)術(shù)后輔助放化療6.1140.0215.8400.032 放療+化療6429(45.31)19(29.69) 放療199(47.37)2(10.53)DDX3的表達(dá)量8.7740.0036.8930.011 ≥0.455119(37.25)9(17.65) <0.453219(59.38)12(37.50)

圖3利用Kaplan-Meier法分析影響轉(zhuǎn)移性乳腺癌生存率的影響因素

Fig. 3 Influencing factors of survival rate for metastatic breast cancer analyzed by Kaplan-Meier

2.5轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后多因素分析

將患者臨床病理資料與患者5年生存情況單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素作為因變量，預(yù)后5年生存情況為自變量進(jìn)行Cox風(fēng)險比例回歸模型分析，分析結(jié)果得到轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移部位數(shù)、DDX3表達(dá)量升高是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，術(shù)后進(jìn)行輔助放化療是患者預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.05)，見表4。

表4 轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后多因素分析

3討論

3.1乳腺癌治療和預(yù)后判斷進(jìn)展

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤，在我國每年有近17萬女性罹患乳腺癌，近年該病的發(fā)病率和死亡率均明顯上升[5]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，乳腺癌易發(fā)在45歲以上的患者尤以絕經(jīng)后女性為多見，70%以上組織學(xué)類型為浸潤性導(dǎo)管癌[6]，本次入選的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中絕大多數(shù)以浸潤性導(dǎo)管癌為主且以絕經(jīng)后女性為主，部分符合既往的主流報道。但有研究指出[7]，年輕患者易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，經(jīng)治療后極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但是我們本次研究通過對入選患者的分析發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者仍以50歲以上患者居多，這與既往的報道不一致。Puig-Vives等[8]和Elkablawy等[9]報道指出疾病的分子分型是預(yù)后的獨立危險因素，本次研究中DDX3的表達(dá)水平在ER/PR陰性與陽性組間表達(dá)存在差異，但是患者3年、5年生存率在ER/PR陰性與陽性組間無明顯差異，不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者主要以淋巴轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移為主，轉(zhuǎn)移部位數(shù)較多者預(yù)后明顯較差。

3.2 DDX3對乳腺癌臨床預(yù)后的判斷作用

DDX3是DEAD盒蛋白RNA解旋酶家族一員，參與RNA代謝的重要過程，已有研究顯示它與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，參與細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控，在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于癌旁組織[4,10]。本研究顯示DDX3在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)，可能的機(jī)制是乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移時，癌細(xì)胞的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡過程失常，導(dǎo)致參與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡調(diào)控的DDX3表達(dá)上調(diào)。此外，DDX3的表達(dá)水平≥0.45在術(shù)后3年的復(fù)發(fā)率明顯高于其表達(dá)水平<0.45者，同時，DDX3的表達(dá)水平≥0.45者的平均復(fù)發(fā)時間也短于其表達(dá)水平<0.45者，提示DDX3的高表達(dá)預(yù)示轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后較差。臨床病理資料與3年、5年生存率的單因素分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移部位數(shù)、術(shù)后輔助放化療、DDX3表達(dá)量是影響患者3年、5年生存率的影響因素(P<0.05)，但Cox多因素分析結(jié)果得到術(shù)后輔助放化療是患者預(yù)后的保護(hù)因素，而轉(zhuǎn)移部位、轉(zhuǎn)移部位數(shù)、DDX3表達(dá)量是患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)。 已有報道證實，疾病的臨床分期每增加一期，患者死亡的風(fēng)險便增加數(shù)倍[2，11]。本次研究中轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者已處于晚期，DXX3的診斷效果依然明顯。利用ROC曲線分析得到DDX3對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)的診斷具有良好的靈敏度和特異度。

綜合以上分析結(jié)果，對于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者檢測其DDX3的表達(dá)對患者預(yù)后的評估具有重要的意義，可為臨床醫(yī)生選擇更優(yōu)的治療方案提供參考依據(jù)，也為臨床開發(fā)靶向治療藥物提供一定的方向。