王曉紅，豆金彥，肖正國

甘肅省中醫(yī)院藥學部，甘肅 蘭州 730050

近年來，隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)持續(xù)發(fā)展，中藥的用藥安全性也隨之成為了關注的焦點。在影響中藥安全性因素中，外源性有害殘留物是其中最主要的一項因素，目前關于這方面的研究主要包括重金屬、農藥、真菌毒素殘留以及二氧化硫等［1］。真菌毒素是一種經由真菌帶來的二次有毒代謝物。目前已經發(fā)現(xiàn)的與人體有關的真菌毒素主要有玉米赤霉烯酮(ZON)、黃曲霉毒素(AF)以及赭曲霉毒素(OTA)等［2］。這些真菌均具有較強的毒性作用，可導致遺傳毒性、生殖發(fā)育毒性以及細胞毒性等。有研究者發(fā)現(xiàn)，薏苡仁中檢出AF或者ZON的頻率非常高，由于薏苡仁非常容易受到真菌毒素的污染，同時其屬于藥食兩用的常見中藥，使用量非常大，且應用范圍較廣。為此，在《中國藥典》中對ZON毒素含量做出了明確的規(guī)定［3］。但真菌的產生與其所處環(huán)境的溫濕度、pH值等均密切相關，為此，模擬不同儲藏環(huán)境，分析薏苡仁真菌含量變化，對控制薏苡仁真菌毒素含量，提高薏苡仁質量具有非常重要的作用［4］。本研究擬運用免疫親和柱凈化-在線柱后光化學衍生-高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)對低溫密封、高溫高濕以及藥店要求通風干燥三種儲藏條件下，薏苡仁的真菌毒素產生情況進行檢測。現(xiàn)報道如下：

1 儀器與試劑［5-10］

1.1 儀器與設備 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津)，光化學衍生器(美國AURA)，熒光檢測器(日本島津，RF-10AXL)，AZ二合一免疫親和柱(中檢維康)，KQ-500超聲儀(昆山超聲儀器)，ZKXF恒溫干燥箱(利康達圣科技)，GF/A玻璃纖維濾紙(美國 VICAM，1.5 μm)等。

1.2 試藥與試劑 薏苡仁樣品(購自甘肅省中醫(yī)院中藥房)。黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素 G2(AFG2)混合對照品溶液；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的濃 度 分 別 為 1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL(均 購 自美國 SUPLCO 公司)α- 玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)對照品(均購自ALDRICH公司)；水為超純水；色譜分析以甲醇作為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 溶液配制

1.3.1 磷酸鹽緩沖液配制 精確稱取磷酸氫二鈉2.9 g、氯化鈉8 g、磷酸二氫鉀0.24 g、氯化鉀0.2 g，以990 mL水進行溶解，繼續(xù)加入水稀釋到1 L。

1.3.2 對照品溶液的制備 運用甲醇將ZON對照品溶液稀釋成0.1 mg/mL使其能夠被作為儲備液；運用甲醇對α-ZOL進行溶解，并稀釋至0.5mg/mL儲備液；運用甲醇對β-ZOL進行溶解，并稀釋至0.5 mg/mL儲備液；AF對照品儲備液則直接購入混合對照品，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 的濃度分別為 1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL。

2 方法

2.1 樣品處理 準備2批薏苡仁，其中一批為自然污染嚴重，另一批為自然污染輕微，將其儲藏在實驗室。第一批樣品：自中藥房中購入一批去殼的薏苡仁，暫時將其儲備在-20℃的冰箱內。在用于儲藏實驗處理之前，首先自冰箱內取出并對水分含量進行調節(jié)，使其達到12%。首先進行預檢測發(fā)現(xiàn)大量ZON與少量AF。該批薏苡仁主要用于對真菌毒素污染水平較高時，不同的儲藏環(huán)境下真菌含量變化的考察。第二批樣品：另從中藥房中購入新鮮未處理薏苡仁，對其進行干燥和脫殼處理，取1.5 kg將其裝入干燥塑料袋內，暫時將其儲存在-20℃的冰箱內。在行儲藏實驗之前，自冰箱內取出，并將其水分含量調整為12%。經過預檢測，并未發(fā)現(xiàn)ZON與AF等其他方面的毒素。該批薏苡仁主要用于對輕微真菌污染或者無真菌毒素污染時，在不同的儲備環(huán)境下，真菌毒素的含量變化以及產生情況進行考察。

2.2 儲藏條件 本研究擬設計低溫密封、高溫高濕以及藥店要求通風干燥3種儲藏條件。1)低溫密封：運用四分法分別從上述2批樣品中各取500 g，將其密封，放置到4℃的冰箱中。2)高溫高濕：運用四分法分別從上述2批樣品中各取500 g，取干凈玻璃皿盛放，放置到30℃的恒溫箱內，在恒溫箱內放置飽和食鹽，濕度控制在75%左右。3)通風干燥：運用四分法分別從上述2批樣品中各取500 g，運用干凈塑料袋盛放并放置到實驗室內，將塑料袋口敞開，保持空氣流通。在實驗過程中，實驗室溫度主要由季節(jié)變化以及中央空調進行調控，通常為15～25℃，濕度為40%左右。

2.3 檢測方法 在不同儲藏條件下，分別儲存0、30、90 天，以四分法均勻稱取 50 g，取樣品，對其 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、α-ZOL、β-ZOL7 種真菌的毒素含量進行定量檢測。采用HPLC-FLD進行檢測。

2.3.1 色譜條件 色譜柱phenomenex Luna 5 μC18(2)100 A(50×2.00 mm 5micron)，流動相：A相，乙腈-0.1%甲酸；B相，水-0.1%甲酸。梯度洗脫程序：0.01～1.5 min，5%A；1.5～2.5 min，5%A～95%A；2.5～5.0 min，95%A；5.0～5.01 min，95%A～5%A；5.01～8.0 min，5%A。流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源為離子源，正負離子方式同時進行檢測，源溫度：500℃，噴霧電壓：(-)4500V，(+)4500V；氮氣作為氣簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)、碰撞氣(CAD)、輔助氣(GS2)，其中CUR：30.0psi，GS1：55.0psi，CAD：Medium，GS2：65.0psi。

3 結果

3.1 薏苡仁AF含量 根據檢測結果來看，自中藥房購入的薏苡仁經過運輸、加工以及保存等各種環(huán)節(jié)而受到污染產生出真菌。在儲藏0天，第一批薏苡仁檢出了AFB1與AFB2，但其含量非常的低，儲藏30天后，均未出現(xiàn)較大的變化。儲藏90天時，AFB1與AFB2含量均有明顯增加，但在干燥通風條件下的樣品，其AFB1與AFB2增長的幅度最大，分別增長了 1.64 μg/kg 與 16.46 μg/kg；在高溫高濕的環(huán)境下，AF的含量增長幅度最少；而在低溫密封條件下，樣品并未出現(xiàn)發(fā)霉情況，但仍然持續(xù)產生AFB1，經過90天的儲備，AFB1的含量達到了4.96 μg/kg，這已經達到了中藥材AF毒素含量的限定值。第二批樣品在儲藏過程中，從最初的不含 AF，到儲藏 30、90天均檢測出 AFB1，但含量非常的少，在0.10～0.16 μg/kg范圍內，但并未發(fā)現(xiàn)其他AF。這表明新鮮的薏苡仁在進行采收之前并沒有受到AF真菌的侵染，或者僅僅受到了輕微的侵染，但未達到形成AF的條件。隨著儲藏時間的延長，儲藏溫濕度等各個方面的條件逐步合適，薏苡仁在儲藏過程中，也隨之產生了AFB1，為此儲藏環(huán)境必須引起我們的共同重視［11］。根據上述結果來看，在通風干燥的條件下對薏苡仁進行儲備，可致使真菌毒素迅速增加，尤其是AFB1與AFB2增加幅度最大；而在高溫高濕的儲藏條件下，AF含量卻未出現(xiàn)較為明顯的變化；而在低溫密封的儲藏條件下，薏苡仁中AF含量表現(xiàn)為緩慢增長。見表1。

表1 不同儲藏條件下薏苡仁AF毒素含量測定結果 μg/kg

3.2 薏苡仁ZOL、ZON含量 根據檢測結果來看，第二批樣品，最初并未含有ZON，但經過一段時間的儲藏后，3種條件下均檢測出了一定的ZON，這表明任何儲藏條件均會致使薏苡仁受到ZON污染。第一批樣品在不同儲藏條件下ZON含量變化與第二批樣品含量變化表現(xiàn)出明顯的一致性。主要表現(xiàn)為：1)在低溫密封的環(huán)境下，新鮮薏苡仁未受到ZON真菌的污染，直至儲藏9天才檢測發(fā)現(xiàn)ZON，含量達到了 126.07 μg/kg；而購自中藥房的薏苡仁樣品，從儲藏0天至儲藏90天，其ZON含量從最初的 177.75 μg/kg，減少了 105.95 μg/kg。2)在高溫高濕與通風干燥的環(huán)境下，ZON含量均表現(xiàn)為先大幅度的上升，再迅速下降，甚至表現(xiàn)為較為明顯的負增長趨勢，但仍然具有較高的殘留值。在儲藏時間達到30天時，通風干燥條件下的薏苡仁ZON含量仍然最高，達到了281.45 μg/kg，該結果與相關研究報道結果一致。有研究者發(fā)現(xiàn)［11-12］，在一定的儲藏環(huán)境下，小麥的ZON含量會表現(xiàn)為非常明顯的先增加再下降的趨勢，同時在22℃時，真菌產毒量明顯較之28℃時更高。在室溫條件下，ZON化學結構非常的穩(wěn)定，而其儲藏過程中出現(xiàn)含量下降，可能是受到溫濕度條件的影響，真菌自身發(fā)生代謝或者其他微生物對其進行了分解等原因所致，但具體的機制還需要作進一步的分析。3)持續(xù)儲藏0、30、90天，無論是加工后薏苡仁(第一批樣品)，還是新鮮薏苡仁(第二批樣品)均未檢測發(fā)現(xiàn)α-ZOL與β-ZOL。根據上述結果來看，在高溫高濕以及通風干燥的環(huán)境下，薏苡仁中ZON會迅速增加，在通風干燥的環(huán)境下，薏苡仁ZON含量所增加的幅度更大，而在低溫密封的環(huán)境下，短時間內可對ZON含量進行抑制。見表2。

表2 不同儲藏條件下薏苡仁ZOL、ZON毒素含量測定結果 μg/kg

4 討論

在通風干燥的儲藏環(huán)境下，薏苡仁非常容易產生大量的ZON與AF。針對該結論，還需大批量研究樣本作驗證真菌毒素的形成與積累的具體機制，以及不同條件下對薏苡仁中真菌毒素含量變化的影響也需要進一步的研究。關于真菌毒素產生的主要階段，不同的研究者看法不同，付朝暉等［7］研究認為真菌除了生長后期會產生真菌毒素，同時在快速線性生長的過程中也會形成大量的真菌毒素。另有研究者［11］表示，真菌毒素非常容易因生長和營養(yǎng)耗竭等因素而受到限制。

通過建立低溫密封、高溫高濕以及通風干燥3種儲藏條件，對薏苡仁進行為期90天的真菌毒素含量變化檢測分析，根據結果來看，在不同的儲藏環(huán)境下，真菌毒素含量會有明顯的改變；在通風干燥的條件下，薏苡仁中ZON與AF兩種毒素的含量會出現(xiàn)非常明顯的增加，伴隨著時間的延長，AF含量也會表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，而ZON則隨著儲藏時間的增加而下降；在高溫高濕的環(huán)境下，AF含量并未出現(xiàn)較為顯著的改變，ZON含量則首先出現(xiàn)非常顯著的升高；在低溫密封儲藏條件下，薏苡仁中ZON與AF的產生與積累的速度都非常的緩慢。