王啟斌

1十堰市太和醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院

豨薟除濕膏是十堰市太和醫(yī)院知名中醫(yī)根據(jù)民間驗(yàn)方和三十余年的臨床使用經(jīng)驗(yàn)而研制的復(fù)方中藥膏劑。本方主要由豨薟草、老鸛草，雞血藤組成，具有祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)的重要功效。主要用于治療風(fēng)濕痹痛、筋骨無(wú)力、腰膝酸軟、四肢麻痹、風(fēng)疹濕瘡等癥。豨薟草為豨薟除濕膏中的君藥，具有很好的祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)的作用，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫都有抑制作用，對(duì)非特異性免疫亦有一定的抑制作用［1-2］。奇壬醇是其主要的藥效成分，研究表明，奇壬醇可通過(guò)調(diào)整機(jī)體免疫功能、改善局部病理反應(yīng)而達(dá)到抗抗風(fēng)濕作用。且能降低麻醉動(dòng)物血壓［3］；腹腔注射奇壬醇對(duì)胸腺有抑制作用，降低血清抗體的滴度，減輕脾臟質(zhì)量，抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，說(shuō)明奇壬醇對(duì)細(xì)胞免疫和非特異免疫均有抑制作用［4］。豨薟草的質(zhì)量研究主要以奇壬醇的含量為指標(biāo)。為將豨薟除濕膏開(kāi)發(fā)為本院特色制劑。本研究對(duì)豨薟除濕膏中奇壬醇進(jìn)行含量測(cè)定，為進(jìn)一步的豨薟除濕膏制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Prominence LC-20AT型液相色譜儀(日本shimadzu公司，二極管陣列檢測(cè)器)；OHAUS DV215CD型電子天平(美國(guó)OHAUS公司，d=0.01 mg)；超聲波清洗器(上海力朗儀器設(shè)備有限公司，功率100W，頻率40 kHz)；奇壬醇對(duì)照品(供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111726-201101)；乙腈(天津大茂，色譜純)；水為雙蒸水；豨薟除濕膏(規(guī)格：400 g/瓶)，本研究所用藥材均經(jīng)過(guò)十堰市藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定，均為《中國(guó)藥典》收載正品來(lái)源。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取奇壬醇對(duì)照品(經(jīng)P2O5減壓干燥器中真空干燥24小時(shí)并至恒重)適量，精密稱定，以甲醇為溶劑配制成濃度為7.65 mg/mL的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取豨薟除濕膏2瓶(同一批號(hào))，混勻，稱取約10.0 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定(十萬(wàn)分之一電子天平)，加甲醇50mL，浸漬30分鐘，稱定質(zhì)量，超聲處理5分鐘(功率500 W，頻率40 kHz)后，將溶液全部通過(guò)GDX-201型大孔吸附樹脂柱(60～80目，內(nèi)徑為1 cm，柱高為12 cm，用甲醇清洗錐形瓶?jī)?nèi)壁，洗液一并通過(guò)大孔吸附樹脂柱)，棄去流出液體，再用5%甲醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，再用35%甲醇洗脫3次，第1次50 mL，第 2次 30 mL，第 3次 20 mL，收集35%甲醇洗脫液，回收甲醇，并濃縮至干，殘?jiān)眉状挤执稳芙?，并完全轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量稱取老鸛草、雞血藤，加10倍量水煎煮二次，每次2小時(shí)，收集揮發(fā)油，合并煎液，靜置，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度1.05，加入煉蜜500 g，混勻，濾過(guò)，濾過(guò)濃縮至相對(duì)密度1.10，放冷，加入提取中的揮發(fā)性成分，混勻，即得，取10.0 g，按供試品溶液制備的方法進(jìn)行處理，得到陰性對(duì)照溶液。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，擬采用Fortis Cortecstm C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫(磷酸調(diào)節(jié)pH6.0)(程序見(jiàn)表1)；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20 μL ；柱溫為 30℃；λ=215 nm［5-7］，在此條件下，奇壬醇色譜峰理論板數(shù)不小于5 000，分離度大于1.5，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 豨薟除濕膏中奇壬醇的HPLC圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 吸取配制好的奇壬醇對(duì)照品溶液 0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL 分別置10 mL量瓶中，以甲醇為溶劑稀釋并定容至刻度，搖勻，得到奇壬醇的濃度分別為0.38、0.76、1.53、3.82、6.12、7.65 mg/mL。分別以上述 6種濃度的奇壬醇對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，色譜條件為系統(tǒng)適應(yīng)性性試驗(yàn)條件，以奇壬醇濃度(X）對(duì)奇壬醇色譜峰面積(Y）進(jìn)行線性回歸，得到奇壬醇濃度對(duì)奇壬醇色譜峰面積的線性回歸方程為：奇壬醇Y=8.749 2X+0.058，r=0.999 9；上述結(jié)果表明，奇壬醇在0.38～7.65 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取奇壬醇對(duì)照品溶液(濃度7.65 mg/mL)20 μL，連續(xù)6次注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，記錄奇壬醇的色譜峰保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果奇壬醇色譜峰的保留時(shí)間穩(wěn)定，其6次的色譜峰面積RSD為1.07%。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將同一批豨薟除濕膏供試品溶液室溫下分別在 0、2、6、12、24 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，按測(cè)定奇壬醇的色譜條件，記錄奇壬醇色譜峰面積，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)色譜峰面積的RSD，結(jié)果為1.34%。2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別將6份批號(hào)為20160309豨薟除濕膏制備成供試品溶液，按相同的色譜條件測(cè)定并記錄奇壬醇的色譜峰面積，同時(shí)計(jì)算出6份豨薟除濕膏中奇壬醇的含量(外標(biāo)兩點(diǎn)法)，結(jié)果6批豨薟除濕膏中奇壬醇平均含量為4.68 mg/g，RSD 為 1.64%。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 將9份批號(hào)為20160309的豨薟除濕膏(奇壬醇的含量為4.68 mg/g)每份稱取5.0 g，用刻度吸管分別加入奇壬醇對(duì)照溶液(濃度為 7.65 mg/mL)2.0、3.0、4.0 mL(3 種不同水平，各3份)，按供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，并按照系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄奇壬醇色譜峰面積，計(jì)算奇壬醇的含量(外標(biāo)兩點(diǎn)法)，結(jié)果奇壬醇的加樣回收率為96.5%，RSD為1.54%。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定 按照制備工藝，制備6批豨薟除濕膏，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件測(cè)定奇壬醇的含量，結(jié)果平均含量為4.47mg/g。見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(±s，n=3) mg/g-

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(±s，n=3) mg/g-

批號(hào) 奇壬醇20160309 4.68±0.16 20160412 4.03±0.13 20160517 3.54±0.06 20160608 4.59±0.11 20160721 5.18±0.04 20160813 4.79±0.12平均值 4.47

3 討論

豨薟除濕膏為我院療效較好的協(xié)定處方，多年的臨床應(yīng)用表明本方適用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕的輔助治療。為了提高本制劑的質(zhì)量可控性。筆者對(duì)方中君藥豨薟草主要藥效成分奇壬醇進(jìn)行了含量測(cè)定，其結(jié)果是穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，能達(dá)到有效控制本品質(zhì)量的目的。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為使奇壬醇色譜峰分離度好，理論塔板數(shù)高，且使分析時(shí)間短，筆者對(duì)色譜條件進(jìn)行了多次試驗(yàn)并調(diào)整。對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究不同流動(dòng)相：甲醇-磷酸、乙腈-醋酸等系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)這些流動(dòng)相系統(tǒng)難以達(dá)到分析測(cè)定的目的。根據(jù)參考文獻(xiàn)對(duì)豨薟草的含量測(cè)定條件，最后確定乙腈-0.05%磷酸二氫鉀溶液體系梯度洗脫能滿足對(duì)奇壬醇含量測(cè)定的要求。對(duì)奇壬醇的紫外最大吸收研究發(fā)現(xiàn)，在215 nm處有最大吸收?，F(xiàn)代藥理研究表明，奇壬醇可抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠產(chǎn)生的白細(xì)胞介素1，從而可阻止大鼠關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)的破壞進(jìn)程，減輕全身及局部病變進(jìn)程。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，奇壬醇對(duì)慢性增生性和糜爛性滑膜炎具有確切療效。本次實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，能分離得到奇壬醇色譜峰，且能和其他雜質(zhì)色譜峰相分離。本研究?jī)?yōu)化的測(cè)定方法具有準(zhǔn)確度好、靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，能有效控制豨薟除濕膏的質(zhì)量，為含有豨薟草的復(fù)方制劑的質(zhì)量研究提供了參考。