焦正花，李文萍，趙鳳菊，禚 君

1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省腫瘤醫(yī)院

清熱解毒沖洗液是裴正學(xué)教授的臨床協(xié)定處方，在臨床應(yīng)用20多年，具有療效好、毒副作用小，可明顯減輕宮頸癌放療后陰道炎癥，減輕陰道黏連及閉鎖，并具有放化療增敏減毒等優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。本協(xié)定處方主要由蛇床子、威靈仙、當(dāng)歸、苦參、紅花、蒲公英、敗醬草、生大黃、赤芍、桃仁等藥物組成，為了在擴大臨床應(yīng)用的同時，保證臨床效果，筆者對清熱解毒沖洗液進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為下一步申報醫(yī)院制劑提供科學(xué)的依據(jù)，現(xiàn)報道如下：

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Agilent多波長紫外檢測器；天津HS6150型超聲波清洗器，METTLER AE240電子天平。甲醇(色譜純)，水為超純水，試劑均為分析純，硅膠-G(青島海洋化工廠)，大黃酸、大黃素、大黃酚對照品(均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為 0773-9809、0756-9908、796-9302)，中藥陰道沖洗劑(甘肅省腫瘤醫(yī)院提供，批號為20150706、20150316、20160425、20160310)。

2 薄層鑒別［1-3］

2.1 當(dāng)歸 取清熱解毒沖洗液30mL，用乙醚20mL振搖提取2次，合并乙醚液，揮干，殘渣加無水乙醇l mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材0.2 g，加乙醚3 mL，浸泡1小時，取上清液作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照藥材溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

2.2 苦參 取清熱解毒沖洗液30 mL，用三氯甲烷20 mL振搖提取2次，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取苦參對照藥材0.5 g，加0.1 mol/L鹽酸溶液30 mL，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯 - 丙酮 - 甲醇(8∶3∶0.5)為展開劑，展開，展距8 cm，取出，晾干，再以甲苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

2.3 大黃 取清熱解毒沖洗液30mL，用乙醚20mL振搖提取2次，合分取乙醚液，揮干，殘渣加無水乙醇l mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0.5 g，加乙醚3 mL，超聲15分鐘，取上清液作為對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯- 甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。置氨蒸汽熏后，斑點變?yōu)榧t色。見圖3—4。

2.4 赤芍 取清熱解毒沖洗液30 mL，蒸干，殘渣加甲醇10 mL，超聲處理15分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取赤芍對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷- 乙酸乙酯 - 甲醇(8∶1∶4)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖5。

圖1 當(dāng)歸TLC色譜圖

圖2 苦參TLC色譜圖

圖3 大黃TLC色譜圖

圖4 大黃TLC色譜圖(氨蒸汽重后)

3 含量測定［2-3］

3.1 系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱：XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相：甲醇 -0.1%磷酸溶液(75∶25)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：室溫；檢測波長：254 nm，理論板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)不低于3 000。

3.2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃酸對照品2.8 mg、大黃素對照品8.95 mg、大黃酚對照品1.75 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液；分別精密量取大黃酸、大黃素、大黃酚各5 mL，置同一25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。(每mL中含大黃酸11.2 μg、大黃素 35.8 μg、大黃酚 7.0 μg)。

3.3 供試品溶液的制備 精密量取供試品10 mL，置分液漏斗中，用乙醚提取3次，每次約30 mL，合并乙醚液，蒸干乙醚，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.4 陰性對照溶液的制備 按樣品處方比例制備不含大黃藥材的樣品，依照樣品含量測定項下方法制成陰性對照溶液。吸取以上3種溶液各10μL按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果陰性樣品無干擾。見圖6。

圖5 赤芍TLC色譜圖

圖6 清熱解毒沖洗液中大黃酸、大黃素、大黃酚含量測定

3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取含大黃酸(11.2μg/mL)、大黃素(35.8 μg/mL)、大黃酚(7.0 μg/mL)的混合對照品溶液 5.0、10、15、20、50 μL，按上述色譜條件依次進(jìn)樣測定，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到回歸方程。大黃酸：Y=6 377.9X-6.04，r=0.999 8；大黃素：Y=3 830.1X+2.08，r=0.999 7；大黃酚：Y=155 64X+7.64，r=0.999 0。結(jié)果表明，大黃酸進(jìn)樣量在 0.056～0.56 μg、大黃素進(jìn)樣量在 0.179～1.79 μg、大黃酚進(jìn)樣量在 0.035～0.35 μg 范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

3.6 精密度實驗 取對照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，計算峰面積，結(jié)果大黃酸RSD=0.83%，大黃素 RSD=0.65%，大黃酚 RSD=0.56%。表明精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性實驗 取配制的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 小時進(jìn)樣，測定峰面積，大黃酸、大黃素、大黃酚峰面積RSD分別為0.95%、1.05%、0.86%。表明供試品溶液在12小時內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.8 重復(fù)性實驗 取同一批號(20150706)樣品，按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計算結(jié)果RSD大黃酸為1.02%、大黃素為0.89%、大黃酚1.20%。表明重復(fù)性較好。

3.9 加樣回收率實驗 取已知含量(批號20150706)的本品5份，分別定量加入大黃酸、大黃素、大黃酚對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，并按上述色譜條件測定峰面積，計算回收率。見表1。3.10 樣品含量測定 取5批清熱解毒沖洗液，分別按“3.3”項下方法制備，吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以外標(biāo)法計算樣品中大黃酸、大黃素、大黃酚的含量。見表2。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果(n＝5)

表2 清熱解毒沖洗液中大黃酸、大黃素、大黃酚含量測定結(jié)果(n＝4) μg/mL

4 討論

宮頸癌患者接受放射治療后可出現(xiàn)一系列近期放療反應(yīng)和遠(yuǎn)期并發(fā)癥。放射性陰道炎作為宮頸癌放療后的常見并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。多數(shù)患者在放療后復(fù)查時，可因陰道炎引起的種種不適，成為除放射性膀胱炎及直腸炎并發(fā)癥外的主要主訴。放射線殺滅癌細(xì)胞的同時，可對陰道壁產(chǎn)生放射性腐蝕，導(dǎo)致放射性陰道炎，表現(xiàn)為陰道腫脹、干澀、疼痛、流液，并發(fā)腰、腹疼痛，婦科檢查見陰道黏膜變薄、糜爛、潰瘍、粘連、狹窄，甚至閉鎖。這些反應(yīng)常出現(xiàn)在放療過程中或治療后。

苦參，別名為苦骨、牛參等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。明代李時珍在《本草綱目 》曰：“苦以味名，參以功名?！毙院犊啵瑲w心、肝、胃、大腸和膀胱經(jīng)。具有清熱燥濕，殺蟲止癢，利尿的功能。主治赤白帶下，陰腫陰癢，常與蛇床子配伍。研究表明苦參主要活性物質(zhì)是生物堿類和黃酮類，具有抗病原微生物、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、利尿、抗心律失常、調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)等多種藥理作用。兩藥合用共奏清熱燥濕、殺蟲止癢的功效［4-5］。

《神農(nóng)本草經(jīng)》載赤芍：“主邪氣腹痛，除血痹，破堅積，寒熱疝瘕，止痛，利小便”，其性味苦、微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛之功能，主要用于治療溫毒發(fā)斑、目赤腫痛、肝郁脅痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、腹痛、跌撲損傷、癰腫瘡瘍等癥。當(dāng)歸、紅花、赤芍、桃仁合用共奏祛瘀活血止痛之功效［6-7］。

《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為當(dāng)歸：“主咳逆上氣，溫瘧寒熱，洗在皮膚中。婦人漏下絕子，諸惡瘡瘍，金瘡?！逼湫詼?，味甘、辛，歸肝、心、脾經(jīng)，具補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功效，主治血虛、血瘀之月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)，為“婦科補血活血，調(diào)經(jīng)止痛之要藥”。近代藥理研究顯示［8］，當(dāng)歸具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保護(hù)臟器器官等作用。

紅花味辛，性溫，歸心、肝經(jīng)?！侗静輩R言》載：“紅花，破血、行血、和血、調(diào)血之藥也?！奔t花是傳統(tǒng)的活血化瘀，祛瘀止痛的中藥，用于治療痛經(jīng)閉經(jīng)、血脈閉塞、跌打損傷等諸證。

桃仁味苦、甘、平，歸心、肝、大腸經(jīng)。《珍珠囊》載：“治血結(jié)、血秘、血燥，潤腸通便，破蓄血”，具活血祛瘀、潤腸通便、止咳平喘之功效，主治瘀血阻滯諸證。

生大黃是內(nèi)服外用皆宜的良藥，味甘、苦、寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的作用，用治熱入營血，溫毒發(fā)斑，陰虛內(nèi)熱，骨蒸勞熱，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘。

蒲公英味苦、甘，性寒，歸肝、胃經(jīng)?！侗静輦湟份d：“專治癰腫、疔毒，亦為通淋妙品。”具清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋的功能，主治疔瘡腫毒、乳癰、瘰疬、目赤、咽痛、肺癰、腸癰、濕熱黃疸、熱淋澀痛。

敗醬草、生大黃、蒲公英合用共奏清熱解毒、消炎止痛之效。諸藥合用具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、殺蟲止癢、消炎止痛、活血祛瘀之功，對因濕、熱、毒邪引起的陰道炎有顯著療效。

本研究結(jié)果表明，本法操作簡便，分離度好，專屬性強，重復(fù)性良好，可以作為清熱解毒沖洗液的質(zhì)量控制。