佟新新,金 鵬,李偉國,劉曉光,路福平,Suren Singh,王正祥
(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院,天津 300457;3. 德班理工大學(xué)食品生物工程系,德班 4001,南非)
β-葡聚糖是由右旋葡萄糖通過 β-1,3-(1,4)-糖苷鍵聚合而成的多糖,是植物細胞壁的主要組成成分之一[1],在谷物、海藻和海帶等生物質(zhì)中含量豐富[2].β-葡聚糖酶是一類能降解β-葡聚糖的水解酶類的總稱.除了作為水解纖維素的重要酶系,β-葡聚糖酶在食品加工、動物飼料、發(fā)酵和紡織等工業(yè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[2-3].按照其水解 β-葡聚糖的特異性,可將β-葡聚糖酶分為 4類,即特異性的 β-1,3-1,4-葡聚糖酶(地衣多糖酶,EC 3.2.1.73)、非特異性的 β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、β-1,3-葡聚糖酶(昆布多糖酶,EC 3.2.1.39)和 β-1,4-葡聚糖酶(纖維素酶E1,EC 3.2.1.4)[4-5].
目前,微生物是β-葡聚糖酶的主要來源.工業(yè)上使用的 β-葡聚糖酶主要來源于曲霉和木霉等絲狀真菌[6-7].盡管研究者們已經(jīng)對許多不同來源(細菌、酵母和絲狀真菌)的內(nèi)切葡聚糖酶進行了基因克隆表達和酶學(xué)性質(zhì)研究,但基本上都是單個酶的研究報道.石潤潤[8]采用構(gòu)建酶庫的方式成功將 22個不同來源的內(nèi)切葡聚糖酶基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中進行了克隆表達,但只對其中3個酶進行了酶學(xué)性質(zhì)研究.迄今為止,還沒有系統(tǒng)研究某一微生物體內(nèi)全部β-葡聚糖酶生化特征的報道.
已知黑曲霉是自然環(huán)境中 β-葡聚糖酶系極為完整與豐富的生物物種,前人從黑曲霉中克隆表達和分離鑒定了多種內(nèi)切葡聚糖酶,包括 En4gB[9-15]、En4gG[16-19]、EglC[20]、XengA[21]等.隨著黑曲霉基因組的解析完成[22],從基因組水平再認識這一物種的內(nèi)切葡聚糖酶系成為可能.本課題組前期將黑曲霉來源的 3個 β-1,3(4)-葡聚糖酶(En3gA、En3gB 和En3gC)進行了基因克隆表達和酶學(xué)性質(zhì)的初步解析[23].在此基礎(chǔ)上,本研究進一步通過基因克隆與異源表達,對黑曲霉基因組中全部可能的內(nèi)切葡聚糖酶進行系統(tǒng)研究與比較分析,解析了其基本組成與酶學(xué)特征.由于此菌同時具有蔗糖酶和內(nèi)切菊粉酶等果糖基水解酶系[24],本研究將為全面認知黑曲霉 β-葡聚糖酶系及其可能的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).
菌株黑曲霉(A.niger)CICIM F0510是從自然樣本分離保藏的野生菌株,由江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心提供[23].大腸桿菌(E.coli)JM109由本實驗室保藏.畢赤酵母(P.pastoris)GS115以及質(zhì)粒pPIC9k購自Invitrogen公司.
黑曲霉通常采用 PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng),為了獲得 eglA基因的 mRNA,培養(yǎng)該菌的培養(yǎng)基(g/L):NaNO33,K2HPO41,MgSO4·7H2O 0.5,KCl 0.5,F(xiàn)eSO40.01,酵母膏 5,蛋白胨 10,乳糖 20,菊粉 10,果糖10.大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng);畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法按照 Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊進行.
PyrobestTMDNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶,大連寶生物工程有限公司;小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒,Omega Bio-Tek公司;酵母基本氮源培養(yǎng)基(YNB)、G418,Sigma Aldrich公司;RNA抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒,Roche公司;氨芐青霉素、3,5-二硝基水楊酸和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,聚合度 800~1200),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;茯苓多糖(含量為 50%),西安森冉生物工程有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物,英國 Oxiod公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純.
1.3.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建
黑曲霉總 RNA的提取以及 cDNA的制備按照試劑盒說明書進行.PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒的純化、酶切、連接、電轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選等參考文獻[24]方法進行.此外,基因克隆過程中所采用的 17對寡核苷酸引物均由上海生工生物工程有限公司合成,其核苷酸序列見表1,下劃線部分為限制性酶切位點.
表1 引物序列Tab. 1 Sequence of primers
續(xù) 表
1.3.2 重組酶的誘導(dǎo)表達與制備
采用前期建立的 MMH-CMC平板篩選法[23]篩選陽性轉(zhuǎn)化子,并通過透明圈大小初步判斷轉(zhuǎn)化子的酶活力.選取酶活力較大的轉(zhuǎn)化子接種到 25mL BMGY 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 A600=2~6(約 16~18h).5000r/min離心 5min后,將酵母細胞重懸于50mL BMMY 培養(yǎng)基中使得 A600=1.0,30℃、200r/min搖床培養(yǎng),每隔24h補加100%甲醇至終體積分數(shù)為 0.5%以維持誘導(dǎo),同時進行取樣測定酶活力.發(fā)酵結(jié)束后,12000r/min離心 10min收集發(fā)酵上清液(即為粗酶液),-20℃保藏備用.
以1% CMC-Na(溶于0.2mol/L磷酸緩沖液,pH 6.0)為底物,采用黏度法[23]對內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力進行測定.1個單位的內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力定義:在50℃、pH 6.0的條件下,每分鐘從1%的CMC-Na溶液中降解釋放1mg CMC所需的酶量.
1.5.1 最適作用溫度的測定
取500μL經(jīng)過適當稀釋的酶液,加入30mL 1%CMC-Na溶液(溶于0.2mol/L磷酸緩沖液,pH 6.0),分別在 30、40、45、50、55、60、70、80℃水浴反應(yīng)30min后,煮沸 10min滅酶.待樣品冷卻至室溫后,用黏度法進行酶活力測定.以酶活力最高者為100%,并計算所處溫度下的相對酶活力.
1.5.2 最適作用pH的測定
分別將重組酶的酶液用pH為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液進行適當稀釋后,取 500μL加入到 30mL用相應(yīng) pH的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制的1%CMC-Na溶液中,于每種酶的最適反應(yīng)溫度下準確反應(yīng) 30min后,煮沸處理10min進行滅酶.冷卻至室溫后,用黏度法進行酶活力測定,并計算重組酶的相對酶活力.
1.5.3 熱穩(wěn)定性的測定
分別取 500μL經(jīng)過適當稀釋的酶液置于 30、40、45、50、55、60、70、80℃的水浴條件下孵育2h.每隔30min取出樣品,在冰上放置10min后,加入30mL 1% CMC-Na溶液.于各種酶的最適反應(yīng)溫度條件下反應(yīng) 30min,采用黏度法測定殘余酶活力,以未進行熱處理酶液的酶活力為 100%,計算相對酶活力.
1.5.4 pH穩(wěn)定性的測定
分別將重組酶的酶液用pH為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液適當稀釋后,取 500μL加入到 3mL相應(yīng) pH的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中,室溫(25℃)孵育 1h.分別加入12mL 0.2mol/LNa2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 6.0),最后加入 15mL 2% CMC-Na溶液(溶于 0.2mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液,pH 6.0),于各種酶的最適反應(yīng)溫度下反應(yīng) 30min,滅酶并冷卻至室溫,然后進行酶活力測定.以酶活力最高者為 100%計算殘余酶活力,確定內(nèi)切葡聚糖酶的pH穩(wěn)定性.
1.5.5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的底物水解特征
按照1.4節(jié)的酶活力測定方法,研究內(nèi)切葡聚糖酶對 CMC-Na的水解特征.以 2mL 1%茯苓多糖溶液(溶于 0.2mol/L的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液,pH 5.0)為底物,加入經(jīng)過適當稀釋的 200μL粗酶液,對照組為200μL畢赤酵母GS115的發(fā)酵液.50℃水浴反應(yīng) 30min后,采用 3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[25]進行酶活力測定,以確定內(nèi)切葡聚糖酶對茯苓多糖的水解特征.
將黑曲霉 CICIM F0510的 17種內(nèi)切葡聚糖酶進行測序后,獲得新的氨基酸序列.利用 Clustal X2軟件對序列進行多序列比對,并通過軟件 MEGA 4.0以鄰近法(Neighbour-joining)構(gòu)建進化樹[26].采用在線軟件MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進行氨基酸序列比對.
依據(jù) A.niger CBS 513.88基因組序列信息(EMBL AM270980—AM270998),采用BLAST等分析方法獲得了確定或疑似內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因信息(共 17個基因).以 A.niger CICIM F0510的cDNA為模板,對上述 17個目標基因進行 PCR擴增.PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、XbaⅠ酶切后,將其克隆入pPIC9K 的 SnaBⅠ和 AvrⅡ位點.經(jīng) PstⅠ酶切驗證和 DNA測序,確認重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.由測序結(jié)果可知,所克隆的 17個基因均具有完整的開放閱讀框(表 2).其中,除了 en4gC、en4gD、en4gF、en3gC、eglC和eglD的序列與A.niger CBS 513.88基因組公布序列有較大差異之外,其他基因的序列與公布序列基本一致.此外,除了 en3gB和 englA不含信號肽,其他基因均含有信號肽.
表2 黑曲霉CICIM F0510內(nèi)切葡聚糖酶的基本特征Tab. 2 Basic properties of endoglucanases from A. niger CICIM F0510
將構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒用限制性酶線性化后,電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中,獲得重組菌.在50mL搖瓶中進行培養(yǎng)時,這17個重組酶的酶活力測定結(jié)果見表3.
表3 17種內(nèi)切葡聚糖酶酶活力Tab. 3 Enzyme activity of 17 endoglucanases
其中,En4gA和 En4gG的酶活力遠高于其他重組酶的.以分泌表達的重組酶液為樣本,進行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究與分析.
2.2.1 最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH
對全部17種黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶進行最適作用pH、最適作用溫度的測定,結(jié)果如圖1所示.
圖1 重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度Fig. 1 pH and temperature optima of recombinant endoglucanases
來源于黑曲霉的17種內(nèi)切葡聚糖酶具有一定的差異性.除了少數(shù)重組酶的最適反應(yīng)溫度為 45℃(En4gA)和 65℃(EglC、En3gA 和 XengA)外,大部分重組酶的最適反應(yīng)溫度均為50~60℃.這17種重組酶的最適反應(yīng)pH都在酸性范圍內(nèi)(pH 3.5~6.0),而且大部分重組酶的最適作用pH均為3.5或5.0.
溫度和pH對17種重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響見表4.所有重組酶的酶活力高于80%的溫度范圍和 pH范圍分別為40~75℃、pH 2.0~8.0.其中,在65℃以上和pH 5.0~5.6范圍內(nèi)具有80%以上酶活力的重組酶有 En4gC、En4gD、En4gE、En4gF、En3gA、EglA和EnglA.
表4 溫度和pH對重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響Tab. 4 Effects of temperature and pH on the activities of recombinant endoglucanases
2.2.2 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性
熱穩(wěn)定性和 pH穩(wěn)定性的研究表明,這 17種內(nèi)切葡聚糖酶的殘留酶活力60%以上的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也存在較大的差異性(表5).
表5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性Tab. 5 Thermo-stability and pH stability of recombinant endoglucanases
所有的重組酶內(nèi)切葡聚糖酶在 40~80℃范圍內(nèi)均具有較好的熱穩(wěn)定性.其中,En4gG、EglC和XengA的熱穩(wěn)定性最好,在 80℃孵育 1h后仍能保留 60%以上的酶活力.大部分重組酶均在中性偏酸的pH范圍內(nèi)具有較好穩(wěn)定性(25℃孵育1h,殘留酶活力大于 60%),XengB是個例外.而且,除了En3gC和EglC,其他重組酶在65~80℃和pH 5.0~5.5內(nèi)都具有較好的穩(wěn)定性.
2.2.3 底物水解特征分析
17種內(nèi)切葡聚糖酶對不同底物的水解特征見表6.由表6可知:這17種內(nèi)切葡聚糖酶對CMC-Na都具有水解作用,說明它們均具有水解 β-1,4糖苷鍵的能力.其中,En4gA和 En4gG的水解能力較強.3gA、En3gB、En3gC、En4gA和En4gB對茯苓多糖也有水解作用,表明它們具有水解 β-1,3糖苷鍵的活性,與文獻報道一致[10,23].
表6 黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶的底物水解特征Tab. 6 Substrate specificities of endoglucanases from A.niger
2.2.4 內(nèi)切葡聚糖酶的分類
采用Clustal X2和MEGA 4.0等生物信息學(xué)的軟件對這 17種重組酶的親緣關(guān)系進行分析,結(jié)果如圖2所示.
圖2 進化樹描述黑曲霉 CICIM F0510內(nèi)切葡聚糖酶的遺傳距離Fig. 2 Phylogenetic tree describing the genetic distances among endoglucanases from A.nigerCICIM F0510
有文獻報道且功能已經(jīng)確認的內(nèi)切葡聚糖酶用粗體表示;線段的長度表示的是MEGA 4.0計算的距離;分支節(jié)點上的數(shù)字代表的是bootstrap百分比.結(jié)合底物水解特征、進化樹以及碳水化合物活性酶(CAZy)分類系統(tǒng)(http://www.cazy.org/),可以將這17種內(nèi)切葡聚糖酶分為 4類:(1)XengA、XengB、En4gG和 En4gE是木葡聚糖特異性(xyloglucan-specific)的內(nèi)切 β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)[18-19,21],它們屬于糖苷水解酶第5家族(GH5),而Rawat等[19]和Master等[21]認為XengA和En4gG屬于糖苷水解酶12家族(GH12).(2)En3gA、En3gB、En3gC[23]、En4gA 和En4gB[10]是內(nèi)切 β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6),可以水解葡聚糖中的 β-1,3和 β-1,4糖苷鍵,屬于糖苷水解酶16家族(GH16).但這5種重組酶分別屬于2個不同的亞類(圖 2),它們之間的區(qū)別還有待進一步研究.(3)EglA、EglB、EglC、EglD 和 En4gF 只具有水解 β-1,4糖苷鍵的能力,是內(nèi)切 β-1,4葡聚糖酶(EC 3.2.1.4),屬于糖苷水解酶第 5家族(GH5).(4)En4gC和 EnglA屬于一類,其中 En4gC是內(nèi)切 β-1,4葡聚糖酶[27],但它們的具體功能還有待進一步的研究確認.
本研究成功將黑曲霉CICIM F0510來源的全部17種內(nèi)切 β-葡聚糖酶基因在畢赤酵母 GS115中進行了克隆表達,獲得的17種重組酶均對CMC-Na具有水解作用.測序的結(jié)果表明,它們的核苷酸和氨基酸序列與菌株 CBS 513.88來源的相應(yīng)序列的相似度,從完全一致到有較大差異不等(表 2).其中,基因 en4gC、en3gC、eglC和 eglD 的氨基酸序列與NCBI上公布的序列差異很大,這可能是由于來源菌株不同造成的.由氨基酸序列比對可知,這 17種內(nèi)切葡聚糖酶之間的氨基酸序列差異性較大,序列相似度為7.49%~62.5%.其中,en4gC和en4gG的氨基酸序列相似度為7.49%,而en4gA和en4gB的氨基酸序列相似度為 62.5%.根據(jù)底物水解特征、進化樹以及CAZy分類系統(tǒng),重新將這17種內(nèi)切葡聚糖酶分為4類(圖 2):(1)木葡聚糖特異性的內(nèi)切 β-1,4-葡聚糖酶(GH5,EC 3.2.1.151);(2)非特異性的內(nèi)切 β-1,3(4)-葡聚糖酶(GH16,EC 3.2.1.6);(3)內(nèi)切 β-1,4-葡聚糖酶(GH5,EC 3.2.1.4);(4)En4gC和EnglA,它們的具體功能還有待進一步確認.
內(nèi)切葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)酶制劑,在啤酒釀造和飼料等工業(yè)應(yīng)用廣泛.在啤酒釀造過程中,麥芽糖化的溫度和 pH 分別為 65~70℃、pH 5.0~5.6[4].因此,啤酒釀造行業(yè)所用的內(nèi)切葡聚糖酶需同時具有良好的耐熱性和耐酸性.本研究中的 En4gC、En4gD、En4gE、En4gF、En3gA、EglA 和 EnglA 的最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng) pH和 pH穩(wěn)定性分別在此溫度和 pH范圍內(nèi),可用于啤酒釀造工程.在飼料微丸包衣過程中,也需要較高的溫度(65~90℃,90s),而且飼料的消化是在畜禽胃腸酸性環(huán)境中(pH 2.6~6.5)進行的[28].除了上述 7種重組酶,En3gC、EglC和 XengA 也適用于飼料顆?;^程.本研究獲得的EglA、EglB、EglC、EglD、En4gD和En4gF等內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶在纖維素乙醇的生產(chǎn)工藝中(50℃、pH 4.8)[29]具有潛在的應(yīng)用價值.4種木葡聚糖特異性的內(nèi)切 β-1,4-葡聚糖酶(En4gE、En4gG、XengA 和 XengB)不僅可以對植物纖維進行改性[30],還可以將經(jīng)過化學(xué)修飾的低聚木糖與木葡聚糖進行連接,從而賦予纖維素微纖絲(cellulose microfibrils)新的功能[31].此外,該酶在食品、紡織和醫(yī)藥行業(yè)也有廣泛應(yīng)用[32].
綜上所述,本研究將黑曲霉來源的 17種內(nèi)切葡聚糖酶在畢赤酵母中進行了克隆表達,并系統(tǒng)解析了它們生化特征的異同點,為同一來源的同類酶(同工酶)超家族的相關(guān)研究以及相關(guān)酶在實際應(yīng)用中協(xié)同作用的研究提供了研究基礎(chǔ).同時,良好的生化特征使得這些內(nèi)切葡聚糖酶在麥芽糖化、飼料顆?;⒗w維素乙醇、食品、紡織以及醫(yī)藥等行業(yè)有著潛在的應(yīng)用價值.