董文煥　祝妍瑾　陳文榮

摘 要 對中學(xué)生物教材中涉及到的植物類實驗材料所使用的經(jīng)典的染色劑，如碘液、斐林試劑、蘇丹III染液、吡羅紅甲基綠染色劑、龍膽紫染液和健那綠染液等，進(jìn)行了歸納總結(jié)，旨在為教材中所涉及的植物類實驗中的染色劑的應(yīng)用及優(yōu)化提供一些研究和思考的方向。

關(guān)鍵詞 中學(xué)生物 染色劑 應(yīng)用 優(yōu)化

中圖分類號 G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

中學(xué)生物學(xué)教材中包含了許多探究性、驗證性和設(shè)計類實驗等，其中許多植物類實驗中涉及到組織、細(xì)胞染色劑，而且不少教材上的染色方法存在著效果不理想等問題。下面通過文獻(xiàn)綜述并結(jié)合實驗室的實踐，對中學(xué)階段植物類實驗的染色劑及使用方法進(jìn)行總結(jié)并對染色方法進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，以提高實驗效果和效率，真正引導(dǎo)學(xué)生勤思考、勤動腦，學(xué)以致用，進(jìn)行相應(yīng)的實驗方法的遷移教育。

1 碘液

碘液是中學(xué)生物實驗室最常用的染色劑之一。例如，觀察人的口腔上皮細(xì)胞、觀察洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞、觀察酵母菌細(xì)胞、觀察玉米種子的結(jié)構(gòu)、探究影響酶活性的條件、探究植物的光合作用以及革蘭氏染色等實驗中都用到碘液。

受到傳統(tǒng)實驗方法和試劑材料的局限，觀察植物表皮細(xì)胞這一實驗教學(xué)實踐中一直使用碘液進(jìn)行染色，實驗教學(xué)缺少創(chuàng)新，染色效果單一且有些觀察效果不佳。筆者以洋蔥鱗片葉表皮為材料進(jìn)行了大量的實驗，建議從有機(jī)試劑（如堿性品紅、亞甲基藍(lán)、固綠、蘇木精等）和無機(jī)染料[如體積分?jǐn)?shù)為24.5%H2SO4、飽和Fe2（SO4）3溶液、飽和CuSO4溶液、物質(zhì)量濃度為0.5 mol/L的Li2SO4溶液等]進(jìn)行單染色和交互染色，以取得更好的染色效果，以求豐富植物細(xì)胞染色色系，并為中學(xué)實驗教學(xué)提供更多的染色方法及更為豐富的染色效果。

碘液在中學(xué)生物實驗中，還廣泛用于淀粉的鑒定。在該實驗中，取2 mL含淀粉的生物組織勻漿的上清液，加入2～3滴碘—碘化鉀溶液，可以將該樣品染成藍(lán)色，原理是淀粉遇碘變藍(lán)色。需要注意的是若使用其他富含淀粉的材料進(jìn)行實驗時，有的材料遇淀粉不顯藍(lán)色，而顯紫色，也是正?，F(xiàn)象，這是由于實驗材料中的支鏈淀粉與碘液發(fā)生了紫色的顯色反應(yīng)。

在驗證酶的專一性的實驗中，常用淀粉酶來催化淀粉水解，而對實驗結(jié)果的驗證都采用淀粉遇碘變藍(lán)這一顏色反應(yīng)。一般是將一定量可溶性淀粉溶液加入試管，調(diào)至實驗所需的溫度和pH條件下，加入淀粉酶，保溫5～10 min，最后向試管中滴加碘液。關(guān)于碘液的滴加順序，有學(xué)者提出了不同的觀點。曹志強(qiáng)做了驗證試驗，并提出了“先加碘液效果更好”的觀點，認(rèn)為其現(xiàn)象明顯，能觀察到反應(yīng)前與反應(yīng)后顏色變化情況，更增強(qiáng)了對比效果。但田久沛等人經(jīng)過研究對其進(jìn)行了糾正，認(rèn)為在進(jìn)行淀粉酶的性質(zhì)實驗時，碘液應(yīng)最后加入，而不能在加入淀粉酶之前加入。其理由如下：一方面，若提前加入，一方面會由于I2的氧化性而使淀粉酶性質(zhì)發(fā)生改變；另一方面，碘與淀粉生成的藍(lán)色復(fù)合物在加熱時會消失，影響對淀粉水解進(jìn)程的判斷。若混合液體的溫度較高，還應(yīng)取出試管，待冷卻后再加入碘液，防止碘在較高溫度下升華。

2 斐林試劑

斐林試劑是由物質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的NaOH溶液（甲液）和0.05 g/mL的CuSO4溶液（乙液）組成的，與可溶性還原糖（葡萄糖、果糖和麥芽糖）在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。但是要注意斐林試劑的甲、乙液要單獨配置和貯存且混合后應(yīng)立即使用，特別在室溫高于35℃的環(huán)境中，堿性新制氫氧化銅懸濁液中的Cu（OH）2將在較短時間內(nèi)分解成黑色CuO沉淀從而影響還原糖的檢測。

針對鑒定還原糖實驗中，斐林試劑的甲、乙溶液是否要混合均勻后才能注入這一問題，有不少研究對此進(jìn)行了研究探討。韓萍為此進(jìn)行了實驗設(shè)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲、乙液混合與不混合差別不是很大，都為磚紅色，憑肉眼根本無法區(qū)分，因此，她認(rèn)為在實驗過程中甲、乙液的加入順序無嚴(yán)格要求。郭衛(wèi)華對其進(jìn)行了改進(jìn)，提出斐林試劑的使用順序?qū)嶒灲Y(jié)果有一定影響，但都能出現(xiàn)磚紅色沉淀，可能是待測液中的有機(jī)酸會中和一些NaOH，使產(chǎn)生的Cu（OH）2不足，所以先加甲液，后加乙液的試管中磚紅色沉淀會少些。

在還原糖的鑒定中，本尼迪特試劑對斐林試劑進(jìn)行改良而得到被廣泛用來替代斐林試劑。經(jīng)驗證，在染色效果上有很好的優(yōu)勢。理論上甘油銅也可替代斐林試劑，還有待進(jìn)一步的證實和研究。

3 蘇丹染液

蘇丹染液是一種脂溶性染料，它和脂質(zhì)有比較強(qiáng)的親和力，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染液接觸時，蘇丹染料便從染液中轉(zhuǎn)移到含脂肪的結(jié)構(gòu)中，使脂肪顯色。脂肪能被蘇丹Ⅲ染液染成橘黃色。用蘇丹染料鑒定脂肪時，實驗所用花生種子材料，必須提前3～4 h浸泡。浸泡時間過短，不易切成薄片；浸泡時間過長，組織太軟，切下的薄片又不易成形。但是在實際的操作中，徒手切片對于中學(xué)生來說有很大的難度，切除的切片往往厚薄不一，導(dǎo)致在鏡下觀察不到被染成橘黃色的脂肪顆粒。經(jīng)過文獻(xiàn)閱讀以及實驗和驗證，筆者發(fā)現(xiàn)撕片法、模仿血涂片法、敲擊壓片法、花生泥法、酒精燈加熱摩擦法均可以取得良好的效果，且蘇丹Ⅳ染液染色效果優(yōu)于蘇丹Ⅲ染液。

在脂類物質(zhì)的鑒定中，也可以從染色劑方面加以改善，建議使用蘇丹Ⅳ染液，脂肪遇蘇丹Ⅳ變?yōu)殚偌t色。理論上蘇丹黑染液或油紅O染液也可以替代蘇丹Ⅲ染液。蘇丹黑是一種脂溶性染料，可溶解于細(xì)胞漿內(nèi)的含脂結(jié)構(gòu)中，使胞漿中的脂類物質(zhì)呈棕黑色或深黑色顆粒；油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。

4 吡羅紅甲基綠染色劑

吡羅紅-甲基綠染色劑在人教版高中生物《必修1·分子與細(xì)胞》中“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”的實驗中發(fā)揮著極其重要的作用，使用該染料時應(yīng)注意要現(xiàn)配現(xiàn)用。由于DNA主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，RNA大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中，堿性染料甲基綠、吡羅紅對DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，而吡羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。所以利用甲基綠-吡羅紅混合染色劑將細(xì)胞染色，可以顯示DNA和RNA在細(xì)胞中的分布。

在實驗材料上，教材中介紹了人的口腔上皮細(xì)胞，此外也提出了可用其他動物或植物細(xì)胞代替，大多數(shù)有關(guān)研究都提倡采用洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞代替口腔上皮細(xì)胞。在染液配方上，有以下兩種改進(jìn)方案：李曉聰對A液的配制進(jìn)行了改進(jìn)，由教材中的取吡羅紅-甲基綠粉1 g進(jìn)行溶解，改為取甲基綠2 g、吡羅紅5 g分別進(jìn)行溶解后再混合的方案，并通過大量的重復(fù)試驗進(jìn)一步探索了染液濃度對實驗的影響，結(jié)果證明將配制的染液稀釋到原濃度的1/6時，實驗效果較穩(wěn)定，重復(fù)性好；吳志強(qiáng)則先用氯仿對甲基綠提純3～4次再進(jìn)行配置，通過多次調(diào)試與對比實驗發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的甲基綠和2%的吡羅紅以5∶1的比例混合配置所形成的染色劑染色效果最好，且能在棕色瓶中密封保存一周。

5 龍膽紫溶液

染色體容易被堿性或酸性染液著色，龍膽紫是一種混合的堿性染料可以將染色體（質(zhì)）染成深藍(lán)色，因此可以作為檢測染色體的物質(zhì)?！坝^察植物根尖組織細(xì)胞的有絲分裂”是中學(xué)生物中難于操作又易失敗的實驗，其中龍膽紫染色要注意時間的把握，不宜太長或太短，否則會導(dǎo)致很難看清細(xì)胞中染色體的變化情況，都會影響實驗效果。關(guān)于染色液的濃度有不少學(xué)者提出了改進(jìn)，大致有以下兩種方案：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%龍膽紫液染色3～5 min，或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%龍膽紫液染色1 min。也有研究驗證，龍膽紫染液按照染色對象有不同的配制方法，效果更好。

除了用龍膽紫溶液外，也可以用醋酸洋紅溶液、Schiff試劑、Giemsa染液或改良苯酚品紅溶液來替代龍膽紫溶液。在日常實驗教學(xué)中，如果僅作臨時裝片來觀察，可以采用孚爾根染色、呂氏堿性藍(lán)染色法、番紅染色法、結(jié)晶紫或龍膽紫染色法、醋酸洋紅染色法、番紅染色法。而要制作永久裝片，區(qū)分比較細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂各個時期和染色體組型分析，建議采用改良苯酚品紅染色法或 Giemsa染色法。

6 健那綠染液

健那綠B是專一性染線粒體的活體染料，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使健那綠B染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)）呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中的健那綠B則被還原，呈現(xiàn)無色的狀態(tài)。

教材中建議制作人口腔上皮細(xì)胞臨時裝片來觀察線粒體，但取材過程要求較高，有時可能觀察不到細(xì)胞。大多數(shù)學(xué)者建議采用洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞作為實驗材料，洋蔥細(xì)胞活性比較強(qiáng)，線粒體數(shù)量多，易觀察。其次，取材時從洋蔥內(nèi)部（之前不切開）取無色透明內(nèi)表皮，少有細(xì)菌干擾。也有研究認(rèn)為大白菜是代替口腔上皮細(xì)胞最理想的植物材料，蔥次之。教材中健那綠染液的配法，染料往往溶解不夠完全，染色完成后常有不少的染料顆粒沉積于標(biāo)本上，影響實驗觀察。因此建議將配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的健那綠B溶液用濾紙過濾，作為原液；臨用前用生理鹽水稀釋50倍用于實驗。這樣既減少染料顆粒的形成，又節(jié)約實驗成本。目前，有實踐進(jìn)一步證明質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.4%～0.8%之間時染色效果最佳。

參考文獻(xiàn)：

[1] 曹志強(qiáng).先加碘液效果更好[J].生物學(xué)教學(xué)，2004，29（1）：39.

[2] 田久沛，孔德新. 淀粉酶的性質(zhì)實驗中碘液的滴加順序問題[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2005，30（10）：47.

[3] 韓萍. 斐林試劑用法再探究[J]. 教育教學(xué)論壇，2013，21：226-227.

[4] 郭衛(wèi)華. 探究斐林試劑和雙縮脲試劑的使用條件[J]. 中學(xué)生物學(xué)，2016，32（1）：49-50.

[5] 侯穎娜，馬會放.“檢測生物組織中的脂肪”實驗改進(jìn)[J]. 生物學(xué)通報，2017，52（05）：55-56.

[6] 尤發(fā)平，劉宏斌，柳婷. 脂肪鑒定試驗方法的改進(jìn)[J]. 2008，43（4）：58.

[7] 霍湘.檢測生物組織中的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)實驗改進(jìn)[J]. 教學(xué)儀器與實驗，2010，26（11）：18-19.

[8] 雷耀華. 高中生物實驗課教學(xué)中如何打造高效課堂——對“檢測生物組織中的糖類、脂肪、蛋白質(zhì)”實驗的改進(jìn)[J]. 考試周刊，2015，34：13-14.

[9] 劉海堅. 探究各種生物組織中脂肪的存在[J]. 中學(xué)生物教學(xué)，2017，（3）：53-54.

[10] 唐海林，唐榮軍，宋穎，彭娟，徐雄峰，張揚. 一種改良的脂肪染色法[J]. 2006，13（2）：153-154.

[11] 李曉聰.“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實驗的再探索[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2012，37（12）：28.

[12] 吳志強(qiáng).“觀察DNA和RNA在細(xì)胞中的分布”實驗的改進(jìn)[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2015，40（7）：48.

[13] 李永華. 生物實驗中龍膽紫液和氯化鈣液濃度的探討[J]. 實驗教學(xué)與儀器，1995，（9）：38.

[14] 申定健. 染色體和細(xì)胞核染色常用的三種堿性染料[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2017，42 （9）：61-62.

[15] 陳曉蕓，林鴻生. 植物細(xì)胞有絲分裂七種染色方法的比較[J]. 生物學(xué)教學(xué)2015，40（10）：43-44.

[16] 張玉代. 利用蔥鱗片葉內(nèi)表皮觀察線粒體[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2011，36（2）：79.

[17] 鄭美婷，傅秋月，楊華. 用高倍顯微鏡觀察葉綠體和線粒體[J]. 中學(xué)生物學(xué)，2015，（12）：60-61.

[18] 肖義軍，俞如旺. 用高倍鏡觀察線粒體實驗的建議[J]. 生物學(xué)教學(xué)，2011，36（2）：60.