劉麗芳 邱芳華 楊澤填 李秋明

摘 要 目的：探討蛇葡萄素（AMP）對皮離蛋白（DCD）過表達(dá)的大腸癌LoVo細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用。方法：通過質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染使DCD在LoVo細(xì)胞中過表達(dá)，并以蛋白免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染后LoVo細(xì)胞中DCD的蛋白表達(dá)水平。將細(xì)胞分為空載體組、正常對照組、陽性藥物組（5-氟尿嘧啶，0.25 μg/mL）和AMP組（300 μmol/L），除空載體組采用轉(zhuǎn)染空載體的LoVo細(xì)胞外，其余組均采用轉(zhuǎn)染DCD的LoVo細(xì)胞，以Transwell小室遷移實驗和劃痕實驗考察AMP對相應(yīng)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響，以Transwell侵襲實驗考察AMP對相應(yīng)LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果：蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和空載體組比較，DCD組細(xì)胞中DCD的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示，與空載體組比較，正常對照組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著增多，細(xì)胞遷移率均顯著升高（P<0.01）；與正常對照組比較，陽性藥物組和AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，細(xì)胞遷移率均顯著降低（P<0.01），且AMP對細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用均顯著優(yōu)于5-氟尿嘧啶（P<0.01）。結(jié)論：DCD過表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲；AMP對DCD過表達(dá)的LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲能力均具有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞 蛇葡萄素；大腸癌；LoVo細(xì)胞；皮離蛋白；遷移；侵襲

中圖分類號 R735.3；R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3053-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.07

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the inhibitory effect of ampelopsin（AMP） on the migration and invasion ability of colorectal cancer LoVo cells with dermcidin（DCD） over-expression. METHODS： DCD in LoVo cells was up-regulated by plasmid transient transfection. Western blot method was used to detect the expression of DCD in transfected LoVo cells. Those cells were divided into empty vector group， normal control group， positive drug group （5-fluorouracil， 0.25 μg/mL） and AMP group （300 μmol/L）. Except LoVo cells transfected with empty vector were adopted in empty vector group， LoVo cells transfected with DCD were adopted in other groups. The effects of AMP on migration ability of LoVo cells were studied by Transwell chamber migration and scratch experiments. The invasion ability of LoVo cells was studied by Transwell invasion experiment. RESULTS： Western blot analysis showed that compared with blank control group and empty vector group， the protein expression of DCD in DCD group were increased significantly （P<0.01）. Results of migration and invasion experiments showed that compared with empty vector group， the number of transmembrane cells and the rate of cell migration were increased significantly in normal control group （P<0.01）. Compared with normal control group， the number of transmembrane cells and the rate of cell migration were decreased significantly in positive drug group and AMP group （P<0.01）； inhibitory effects on migration and invasion of AMP were better than 5-fluorouracil （P<0.01）. CONCLUSIONS： Over-expressed DCD could promote the migration and invasion of tumor cells. AMP can significantly inhibit migration and invasion ability of LoVo cells with DCD over-expression.

KEYWORDS Ampelopsin； Colorectal cancer； LoVo cell； Dermcidin； Migration； Invasion

大腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第2位、男性惡性腫瘤第3位[1]。隨著生活和飲食方式的改變，大腸癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢[2]。目前大腸癌的治療仍以手術(shù)治療為主，輔以放化療、靶向治療等，患者術(shù)后5年總生存率為50%左右[3]，其中發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅約為19%[4]。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、治療失敗和死亡的主要原因，而放化療和靶向治療藥物又有一定的毒副作用，因此尋找抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物，特別是高效低毒的抗腫瘤藥物一直是臨床研究熱點。

蛇葡萄素（Ampelopsin，AMP）是中藥材藤茶的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、改善循環(huán)、提高免疫力等多種藥理作用，其抗腫瘤作用較強、毒性低、副作用小，且價廉易得，比靶向藥物成本低[5]，作為一種天然來源的抗腫瘤藥具有一定優(yōu)勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，AMP抗腫瘤機制主要包括：抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制新生血管形成，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、運動和黏附等[6]。

已有研究證實，皮離蛋白（Dermcidin，DCD）在肝癌組織及細(xì)胞、肺癌組織及血清、大腸癌組織中的表達(dá)均明顯升高[7-9]，提示其可能是上述腫瘤的治療靶點之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DCD能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10-11]。本研究選擇遷移性和侵襲性均較強的大腸癌LoVo細(xì)胞[12]為對象，通過質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染實現(xiàn)DCD在LoVo細(xì)胞中的過表達(dá)，并考察AMP對DCD過表達(dá)的LoVo細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用，為將AMP開發(fā)為有效的臨床抗腫瘤藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HF-90型細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（無錫耐思生物科技有限公司）；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室（美國Corning公司）；BDS200型倒置光學(xué)顯微鏡（北京奧特偉業(yè)光學(xué)儀器有限公司）；TGL-16R型高速冷凍離心機（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

AMP原料藥（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-17031501，純度：98%）；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：FA170507，規(guī)格：10 mL ∶ 0.25 g）；DCD質(zhì)粒（廣州吉賽生物科技股份有限公司，批號：170812L35）；Lipofectamine 2000試劑（美國英杰生命技術(shù)有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；兔抗人DCD單克隆抗體（英國Abcam公司）；鼠源GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（二抗，天津三箭生物技術(shù)有限公司）；多聚甲醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；ECL電化學(xué)發(fā)光液[安迪福諾生物科技（武漢）有限公司]；Matrigel膠（美國BD公司，批號：MA01730）；胎牛血清[上海依科賽生物科技（太倉）有限公司]；青霉素、鏈霉素、胰酶（廣州碧云天生物技術(shù)有限公司）；結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為分析純，磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）為實驗室自制，水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

人大腸癌LoVo細(xì)胞（廣州吉賽生物科技股份有限公司傳代凍存）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。

2.2 DCD瞬時轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞

取LoVo細(xì)胞接種于6孔板（5×105個/mL）中，待細(xì)胞融合至80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以無血清DMEM/F12培養(yǎng)基（以下簡稱“無血清培養(yǎng)基”）100 μL稀釋DCD質(zhì)粒2.5 μg；另以無血清培養(yǎng)基100 μL稀釋Lipofectamine 2000試劑4 μL，室溫放置5 min；將稀釋好的DCD質(zhì)粒和Lipofectamine 2000試劑混合，室溫放置20 min，以形成DCD質(zhì)粒-Lipofectamine 2000復(fù)合物。取該復(fù)合物200 μL加至每孔含無血清培養(yǎng)基800 μL的培養(yǎng)板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 h后，完成DCD在大腸癌LoVo細(xì)胞中的瞬時轉(zhuǎn)染；然后吸棄無血清培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。另制備不含DCD的空載體轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，除不加入DCD質(zhì)粒外，其他操作同上。

2.3 轉(zhuǎn)染后LoVo細(xì)胞中DCD蛋白表達(dá)水平檢測

采用蛋白免疫印記法檢測。將細(xì)胞分為空白對照組（LoVo細(xì)胞）、空載體組（空載體轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞）、DCD組（DCD轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞）。取相應(yīng)的對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞，胰酶消化，以培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液（1×106個/mL），接種于6孔板中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后加入蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，并以二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。取總蛋白依次經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等，再加入DCD單克隆抗體（1 ∶ 1 000）和GAPDH抗體（1 ∶ 5 000），4 ℃孵育過夜，然后加入二抗（1 ∶ 5 000），室溫孵育40 min。采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，以Quantity One 4.52分析軟件測定條帶灰度值，對各組條帶進(jìn)行灰度分析。目的蛋白的相對表達(dá)量（IOD）=目的蛋白DCD灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

2.4 細(xì)胞遷移實驗

2.4.1 Transwell小室遷移實驗 將細(xì)胞分為空載體組、正常對照組、陽性藥物組和AMP組（除空載體組采用轉(zhuǎn)染空載體的LoVo細(xì)胞外，其余組均采用轉(zhuǎn)染DCD的LoVo細(xì)胞進(jìn)行實驗）。取相應(yīng)的對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，以無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液（1×106個/mL）。將Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室放置于24孔板底部，上室中加入細(xì)胞懸液100 μL/孔，分別加入相應(yīng)藥物（根據(jù)預(yù)實驗，陽性藥物5-FU、AMP終質(zhì)量濃度分別設(shè)為0.25 μg/mL、300 μmol/L；空載體組、正常對照組加入等容無血清培養(yǎng)基），下室中加入600 μL培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)完畢后取出小室，用棉簽擦去上室膜內(nèi)表面殘留細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定15 min，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色5 min。在倒置光學(xué)顯微鏡下隨機選取6個視野，觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，讀取各個視野中的平均跨膜細(xì)胞數(shù)。

2.4.2 細(xì)胞劃痕實驗 按“2.4.1”項下方法分組。取相應(yīng)的對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，以無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液（5×105個/mL），接種于6孔板中，分別加入相應(yīng)藥物，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁密度至80%～90%時，用移液槍取細(xì)胞液垂直均勻劃痕，以PBS清洗1次除去細(xì)胞碎片，加入培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。每組設(shè)置3個復(fù)孔。采用Photoshop 7.0軟件分析細(xì)胞的遷移距離，并計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=（0 h劃痕間距-不同時間點劃痕間距）/0 h劃痕間距×100%。

2.5 Transwell侵襲實驗

按“2.4.1”項下方法分組。4 ℃下溶解Matrigel膠過夜后，加入3倍體積比的預(yù)冷無血清培養(yǎng)基稀釋。取稀釋后的Matrigel膠100 μL加入預(yù)冷的Transwell小室中，37 ℃孵育1.5 h使Matrigel膠凝固，吸棄多余的Matrigel膠。然后按“2.4.1”項下“上室中加入細(xì)胞懸液100 μL/孔……”起同法操作，讀取倒置光學(xué)顯微鏡下視野中的平均跨膜細(xì)胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。各實驗均獨立重復(fù)3次。計量資料用x±s表示，采用t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較，并以GraphPad Prism 6.0軟件作柱形圖分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LoVo細(xì)胞中DCD的蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

與空白對照組、空載體組分別比較，DCD組細(xì)胞中DCD的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明DCD成功轉(zhuǎn)染到LoVo細(xì)胞中。各組細(xì)胞中DCD的蛋白表達(dá)電泳圖見圖 1，蛋白表達(dá)水平柱形圖見圖2。

3.2 AMP對過表達(dá)DCD的LoVo細(xì)胞遷移能力的影響

3.2.1 Transwell小室遷移實驗結(jié)果 空載體組、正常對照組、陽性藥物組和AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)均值分別為101.35±1.32、174.33±5.13、74.67±1.43、69.67±2.08。與空載體組比較，正常對照組跨膜細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明DCD轉(zhuǎn)染后能促進(jìn)LoVo細(xì)胞的遷移。與正常對照組比較，陽性藥物組和AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示AMP對過表達(dá)DCD的LoVo細(xì)胞的遷移能力均有明顯抑制作用。各組細(xì)胞遷移實驗顯微圖見圖3，跨膜細(xì)胞數(shù)柱形圖見圖4。

3.2.2 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果 0 h時，空載體組、正常對照組、陽性藥物組和AMP組細(xì)胞劃痕間距基本相同；24、48 h時，各組細(xì)胞劃痕間距均變窄，正常對照組細(xì)胞在48 h時劃痕甚至已消失，各組細(xì)胞遷移率分別為62%、75%、61%、50%（24 h時）與85%、100%、95%、88%（48 h時）。與空載體組比較，24、48 h時，正常對照組細(xì)胞遷移率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明DCD轉(zhuǎn)染后能促進(jìn)LoVo細(xì)胞的遷移。與正常對照組比較，24、48 h時，陽性藥物組和AMP組細(xì)胞遷移率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與陽性藥物組比較，24、48 h時，AMP組細(xì)胞遷移率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這提示，AMP對過表達(dá)DCD的LoVo細(xì)胞的遷移能力有明顯的抑制作用，且作用優(yōu)于5-FU。各組細(xì)胞劃痕實驗顯微圖見圖5，遷移率柱形圖見圖6。

3.3 AMP對過表達(dá)DCD的LoVo細(xì)胞侵襲能力的影響

空載體組、正常對照組、陽性藥物組和AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)均值分別為83.26±1.05、125.67±5.13、103.04±3.01、60.67±2.08。與空載體組比較，正常對照組跨膜細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明DCD轉(zhuǎn)染后能促進(jìn)LoVo細(xì)胞的侵襲。與正常對照組比較，陽性藥物組和AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與陽性藥物組比較，AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這提示，AMP對過表達(dá)DCD的LoVo細(xì)胞的侵襲能力有明顯抑制作用，且作用優(yōu)于5-FU。各組細(xì)胞侵襲實驗顯微圖見圖7，跨膜細(xì)胞數(shù)柱形圖見圖8。

4 討論

腫瘤細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移不可或缺的重要步驟，其發(fā)生是一個多因素、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，涉及到腫瘤細(xì)胞黏附、遷移運動、基質(zhì)降解、新生血管生成、腫瘤微環(huán)境變化、腫瘤細(xì)胞免疫逃逸等多方面的作用機制[10，13]。大量研究已證實，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移速度越快，腫瘤轉(zhuǎn)移能力越強。尋找腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中能起到抑制作用的藥物，避免腫瘤最終在機體內(nèi)擴散，成為腫瘤治療亟待解決的問題。

AMP作為一種源自中藥材的天然活性物質(zhì)，在抗腫瘤方面有明顯的優(yōu)勢。已有研究發(fā)現(xiàn)，AMP能通過下調(diào)趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的特異受體（CXCR4），抑制前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲[14]；在體內(nèi)外均能明顯抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的侵襲、運動和黏附[15]；能通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來減少卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]；能通過p38絲裂原活化蛋白激酶/基質(zhì)金屬蛋白酶2（p38MAPK/MMP-2）信號通路抑制腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。然而AMP對大腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響的研究較少。

DCD是由一種新發(fā)現(xiàn)的由位于人類12號染色體上的調(diào)控基因所編碼的多肽[18]。研究發(fā)現(xiàn)，DCD與肝癌、黑素瘤等的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，能明顯促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[10，19]。本研究通過質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染法使DCD在大腸癌LoVo細(xì)胞中過表達(dá)。蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，DCD轉(zhuǎn)染后LoVo細(xì)胞中DCD的蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明DCD已成功轉(zhuǎn)染到LoVo細(xì)胞中。通過遷移實驗和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，與空載體組比較，正常對照組跨膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均顯著升高，表明DCD能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

5-FU是治療胃腸道惡性腫瘤常用的藥物。本研究以其作為陽性對照藥物，通過遷移實驗和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，5-FU組和AMP組跨膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均顯著減少或降低，提示兩者均能夠有效抑制LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲；且與化療藥物5-FU比較，AMP對細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用更強。

綜上所述，AMP對過表達(dá)DCD的大腸癌LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有顯著的抑制作用，提示其具有減緩大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛力，有望開發(fā)為有效的臨床抗腫瘤藥物。但本結(jié)論僅來自于體外研究，AMP在體內(nèi)是否也有類似的效果，另外DCD在大腸癌中的具體作用及其機制仍需要進(jìn)一步深入探索。

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（收稿日期：2018-05-15 修回日期：2018-09-28）

（編輯：段思怡）