巫圣乾 張璐 龔夢(mèng)鵑 王淑美 梁生旺 鄒忠杰

摘 要 目的：從代謝層面探索黃獨(dú)素B致小鼠急性肝損傷的潛在生物標(biāo)志物，研究其肝毒性作用機(jī)制。方法：將24只小鼠隨機(jī)分成正常組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）和黃獨(dú)素B組（200 mg/kg），每組12只。一次性灌胃給予相應(yīng)藥物24 h后，檢測(cè)小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平和肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；采用蘇木精-伊紅染色法觀察肝組織病理學(xué)變化；采用核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測(cè)尿液和肝組織中的代謝產(chǎn)物水平，并采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選黃獨(dú)素B肝毒性的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果：與正常組比較，黃獨(dú)素B組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著上升，肝組織中MDA水平顯著上升、SOD水平顯著下降（P<0.05）；肝組織細(xì)胞受損，出現(xiàn)明顯病理性改變；尿液和肝組織中代謝產(chǎn)物水平發(fā)生顯著改變，各篩選得到3種和6種與肝損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物（P<0.05），分別為α-酮戊二酸、二甲胺、氧化三甲胺（尿液）和谷胱甘肽、?；撬?、肌苷、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸（肝組織）。結(jié)論：黃獨(dú)素B主要是通過(guò)自由基氧化作用損傷肝細(xì)胞，其對(duì)機(jī)體三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、腸道菌群產(chǎn)生影響可能是其肝毒性的作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞 黃獨(dú)素B；急性肝損傷；肝毒性；代謝組學(xué)；核磁共振氫譜；小鼠

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）22-3046-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.05

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore potential biomarkers of acute hepatic injury induced by diosbulbin B and study its hepatotoxicity mechanism from metabolic aspect. METHODS： Totally 24 mice were randomly divided into normal group （0.5% sodium carboxymethylcellulose solution） and diosbulbin B group （200 mg/kg）， with 12 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically； 24 h later， the levels of ALT， AST in serum and MDA， SOD in liver tissue were determined. HE staining was used to observe the histopathological changes of liver tissue. The levels of metabolism products in urine and liver tissue were determined by 1H-NMR. The potential biomarkers of diosbulbin B hepatotoxicity were screened by OPLS-DA. RESULTS： Compared with normal group， the levels of ALT and AST in serum， the level of MDA in liver tissue were increased significantly in diosbulbin B group， while the level of SOD in liver tissue was decreased （P<0.05）. The liver cells were damaged，with marked pathological changes. The levels of metabolic products were significantly changed in urine and liver tissue. Three and six potential biomarkers related to acute hepatic injury were obtained （P<0.05）， i.e. α-ketopglutaric acid， dimethylamine， trimethylamine oxide （urine） and glutathione， taurine， inosine， tyrosine， phenylalanine， histidine （liver tissue）. CONCLUSIONS： The hepatic injury induced by diosbulbin B are caused by free radical oxidation. The mechanism of hepatotoxicity may be the effect of diosbulbin B on tricarboxylic acid cycle， amino acid metabolism and intestinal flora.

KEYWORDS Diosbulbin B；Acute hepatic injury；Hepatotoxicity； Metabonomics； 1H-NMR； Mice

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(dú)（Dioscorea bulbifera L.）的干燥塊莖，其藥性苦寒，歸脾、肝經(jīng)，具有消痰散結(jié)、清熱解毒之功效[1]。研究表明，黃藥子具有抗癌、抗菌、止痛、抗炎等藥理作用[2]，但同時(shí)具有肝毒性，可引起小鼠肝損傷[3]。黃獨(dú)素B（Diosbulbin B）屬于二萜內(nèi)酯類化合物，為黃藥子的主要毒性成分[4-5]，深入研究其肝毒性對(duì)黃藥子的開發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要意義。

代謝組學(xué)是20世紀(jì) 90 年代中期發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，其是通過(guò)分析生物體因病理、生理刺激或基因改變所致的代謝產(chǎn)物的變化來(lái)研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)[6]。核磁共振氫譜（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)是代謝組學(xué)研究中最常用的一種技術(shù)，具有不破壞樣本、分辨率高及重現(xiàn)性佳等的優(yōu)點(diǎn)[7]，適用于中藥等復(fù)雜成分的分析。已有研究采用代謝組學(xué)技術(shù)分析了黃藥子乙醇提取物致大鼠肝損傷的生物標(biāo)志物[8]，并通過(guò)膽汁酸代謝網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)黃藥子和黃獨(dú)素B誘導(dǎo)肝損傷的作用機(jī)制可能與膽汁酸及脂肪酸代謝密切相關(guān)[9-10]。本研究利用1H-NMR技術(shù)對(duì)黃獨(dú)素B致小鼠急性肝損傷后尿液和肝組織的代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行研究，鑒定相關(guān)潛在的生物標(biāo)志物，以明確黃獨(dú)素B肝損傷作用的代謝通路，為揭示其肝毒性的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

AVANCE Ⅲ 500 MHz型全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）；ELX-808型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；1-14型低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；Vectra智能切片分析系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer公司）。

1.2 藥品與試劑

黃獨(dú)素B單體化合物（廣東雋沐生物科技有限公司，批號(hào)：wkq16120204，純度：99.47%）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20171022、20171021、20171024、2017102）；疊氮化鈉（NaN3，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海滬試實(shí)驗(yàn)器材股份有限公司）；氘水（D2O）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、3-（三甲基甲硅烷基）氘代丙酸鈉（TSP-d4）（美國(guó)Sigma公司）；乙腈為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0167。動(dòng)物均在室溫（20±2）℃、相對(duì)濕度50%的屏障環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組與給藥

取24只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組和黃獨(dú)素B組，每組12只。參照文獻(xiàn)[4]方法并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黃獨(dú)素B組小鼠一次性灌胃黃獨(dú)素B混懸液（200 mg/kg，給藥前以0.5% CMC-Na溶液制成10 mg/mL的混懸液）；正常組小鼠灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。

2.2 生物樣本的取樣

給藥24 h后，選取正常組和黃獨(dú)素B組小鼠各6只，于眼眶后靜脈叢取血并置于離心管，室溫下凝固后，在4 ℃條件下以4 000 r/min離心10 min，取上層血清，進(jìn)行血清實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)；然后頸椎脫臼處死小鼠，剖取肝臟，進(jìn)行肝組織實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)和病理組織學(xué)檢查。兩組其余6只小鼠于給藥后分別放置于代謝籠內(nèi)，收集24 h尿液（集尿器置于冰上，并加入1% NaN3溶液作為防腐劑），然后頸椎脫臼處死小鼠并剖取肝臟，進(jìn)行尿液和肝組織代謝組學(xué)分析。

2.3 血清和肝組織實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下小鼠血清，檢測(cè)ALT、AST水平；取“2.2”項(xiàng)下小鼠部分肝組織制成勻漿，在4 ℃條件下以3 500 r/min離心10 min，取上清，檢測(cè)MDA、SOD水平。試驗(yàn)嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.4 肝組織病理學(xué)觀察

取“2.2”項(xiàng)下小鼠另外部分肝組織，以10%福爾馬林溶液固定12 h以上，依次進(jìn)行乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋，切片（5 μm）并脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色。置于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝組織的病理學(xué)變化情況。

2.5 尿液和肝組織代謝組學(xué)分析

2.5.1 尿液樣本處理 取“2.2”項(xiàng)下小鼠尿液樣本400 μL，加入PBS 200 μL后靜置20 min，在4 ℃條件下以 3 500 r/min離心10 min。取上清液500 μL加至NMR樣品管中，再加入含0.05% TSP-d4的D2O 50 μL，振蕩混勻，轉(zhuǎn)移至核磁管中待測(cè)。

2.5.2 肝臟樣本處理 取“2.2”項(xiàng)下小鼠肝臟小葉樣本，稱質(zhì)量后按5 mL/g的量加入50%乙腈制成勻漿，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min。取上清液750 μL凍干后，加入PBS 450 μL和含0.05% TSP-d4的D2O 450 μL溶解，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液550 μL轉(zhuǎn)移至核磁管中待測(cè)。

2.5.3 1H-NMR數(shù)據(jù)采集及分析 設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度為298 K，采用預(yù)飽和的1D NOESY脈沖序列壓制水峰，采樣時(shí)間為3.28 s，弛豫延遲時(shí)間為3.0 s；設(shè)置樣本譜寬為10 kHz，采樣點(diǎn)數(shù)為64 K，采集次數(shù)為128次；采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換。采用MestReNova 6.1軟件對(duì)所獲1H-NMR圖譜進(jìn)行手動(dòng)相位和基線校正后，參照TSP-d4（δ0）對(duì)圖譜的化學(xué)位移進(jìn)行定標(biāo)。在δ0.5～9.5區(qū)域按δ0.01等間隔分段積分，對(duì)于尿液和肝組織樣本，分別將區(qū)域δ4.47～6.01和δ4.68～5.20設(shè)為0積分段，然后采用Excel 2010軟件對(duì)圖譜各分段積分值進(jìn)行歸一化處理。將所得數(shù)據(jù)乘以10 000后導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件，經(jīng)Pareto標(biāo)度化預(yù)處理后，進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。

2.5.4 模型可靠性驗(yàn)證及代謝物鑒定 采用7倍交叉驗(yàn)證法對(duì)OPLS-DA 模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證[11]，得到OPLS- DA模型的主要參數(shù)。尿液：R2X（cum）=0.70，R2Y（cum）=0.90，Q2（cum）=0.81；肝組織：R2X（cum）=0.87，R2Y（cum）=0.83，Q2（cum）=0.89。從上述參數(shù)可以看出本模型具有較高的可靠性。然后，根據(jù)化學(xué)位移值、峰的裂分、耦合常數(shù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]對(duì)代謝物譜峰進(jìn)行鑒定。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清和肝組織實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，黃獨(dú)素B組小鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平均顯著上升，肝組織中SOD水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明黃獨(dú)素B可造成小鼠肝組織損傷。兩組小鼠血清中ALT、AST和肝組織中MDA、SOD水平檢測(cè)結(jié)果見表1。

3.2 小鼠肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常組小鼠肝組織細(xì)胞邊界清晰、排列整齊、形態(tài)正常，未見組織病理學(xué)異常；黃獨(dú)素B組小鼠肝組織細(xì)胞出現(xiàn)少量脂肪樣變性，部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫，表明黃獨(dú)素B對(duì)小鼠肝組織細(xì)胞造成了損傷，引起了明顯的肝組織病理性改變。兩組小鼠肝組織病理學(xué)顯微圖見圖 1。

3.3 小鼠尿液和肝組織代謝組學(xué)分析結(jié)果

小鼠尿液和肝組織的1H-NMR圖譜見圖2、圖3；正常組與黃獨(dú)素B組小鼠代謝物差異的OPLS-DA分析結(jié)果見圖4。由圖4可見，黃獨(dú)素B組與正常組樣本點(diǎn)在PC1維上可以完全分開，表明黃獨(dú)素B引起小鼠肝損傷后使機(jī)體的代謝表型發(fā)生了明顯變化。

選取OPLS-DA 模型中變量重要性投影參數(shù)VIP>1的差異變量，再用t檢驗(yàn)對(duì)篩選到的差異變量在黃獨(dú)素B組與正常組之間進(jìn)行驗(yàn)證，以變量差異的P<0.05判定其為潛在的生物標(biāo)志物[14]。按照上述原則，最終在尿液和肝組織中分別篩選得到α-酮戊二酸等3種和谷胱甘肽等6種代謝物的峰面積差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），判定其為黃獨(dú)素B肝毒性相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，詳見表2。

4 討論

4.1 黃獨(dú)素B造成肝損傷的作用機(jī)制

ALT、AST在正常狀態(tài)時(shí)即存在于肝細(xì)胞中，兩者水平明顯上升則表明肝細(xì)胞受到了損傷[15]；MDA為機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其水平的高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊后的損傷程度；SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的主要物質(zhì)，其可對(duì)抗與阻斷自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞[16]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，黃獨(dú)素B組小鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平均顯著上升，肝組織中SOD水平顯著下降，表明黃獨(dú)素B可通過(guò)自由基氧化作用而損傷肝細(xì)胞。

肝細(xì)胞脂肪樣變性的主要原因?yàn)橹|(zhì)蛋白合成障礙、中性脂肪合成過(guò)多、細(xì)胞發(fā)生水腫[17-18]。本研究結(jié)果顯示，黃獨(dú)素B組小鼠肝組織細(xì)胞發(fā)生了脂肪樣變性及水腫。其原因可能是黃獨(dú)素B引起小鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常，并通過(guò)自由基氧化作用損傷細(xì)胞膜，造成細(xì)胞膜通透性增加，從而使其發(fā)生水腫。

4.2 黃獨(dú)素B引發(fā)肝損傷后機(jī)體的多參數(shù)代謝應(yīng)答

谷胱甘肽能激活各種酶，在三羧酸循環(huán)中起到重要作用，能促進(jìn)脂肪、蛋白質(zhì)、糖代謝，使機(jī)體獲得高能量，進(jìn)而影響細(xì)胞的代謝過(guò)程[19]，改善中毒性肝炎、感染性肝炎的癥狀。肌苷為腺嘌呤的前體，能活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，而輔酶A與人體能量代謝、物質(zhì)合成、免疫系統(tǒng)的激活都密切相關(guān)，其可使組織細(xì)胞在低能量、缺氧狀態(tài)下繼續(xù)順利進(jìn)行代謝[20]。本研究結(jié)果顯示，黃獨(dú)素B組小鼠肝組織中谷胱甘肽和肌苷水平均顯著下降，說(shuō)明其體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)等的代謝受到影響，能量代謝減少，提示小鼠發(fā)生肝損傷使得肝組織能量代謝水平下降。

牛磺酸具有滲透調(diào)節(jié)、抗氧化、穩(wěn)定細(xì)胞膜等生理作用[21]，可通過(guò)減弱氧化應(yīng)激和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)緩解長(zhǎng)期飲酒造成的肝損傷[22]。本研究結(jié)果顯示，黃獨(dú)素B組小鼠肝組織中?；撬崴斤@著降低，表明黃獨(dú)素B可能通過(guò)氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過(guò)氧化兩方面造成肝損傷。另外，?；撬峥膳c游離膽汁酸結(jié)合形成結(jié)合型膽汁酸，飲食中的脂肪酸又能改變膽汁酸成分[8]，而膽汁酸又可對(duì)腸道菌群產(chǎn)生影響。因此，?；撬岷湍懼峋c腸道菌群有較密切關(guān)系，其水平變化提示黃獨(dú)素B的肝毒性可能與腸道菌群改變有關(guān)。

α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，連接著細(xì)胞內(nèi)的碳-氮代謝，參與體內(nèi)多種物質(zhì)的合成代謝[23]；酪氨酸、苯丙氨酸代謝通路主要在肝組織中進(jìn)行，其水平的變化與肝功能密切相關(guān)[24]；氧化三甲胺與二甲胺為腸道菌群代謝活動(dòng)的產(chǎn)物，膽堿在腸道內(nèi)經(jīng)由腸道微生物作用生成三甲胺，進(jìn)而被代謝成氧化三甲胺與二甲胺[25]。本研究結(jié)果顯示，黃獨(dú)素B組小鼠體內(nèi)酪氨酸、苯丙氨酸、α-酮戊二酸水平均異常升高，提示肝細(xì)胞內(nèi)線粒體活性下降，相關(guān)代謝物堆積，最終導(dǎo)致能量合成減少、細(xì)胞受損；同時(shí)，氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸）水平顯著上升，提示氧化應(yīng)激可能造成了肝組織氨基酸代謝紊亂及蛋白質(zhì)變性降解[26]；而氧化三甲胺與二甲胺水平的異常變化則說(shuō)明黃獨(dú)素B可能引起小鼠腸道菌群生態(tài)的破壞，導(dǎo)致腸道菌群功能失常。本研究結(jié)果顯示，黃獨(dú)素B能分別使小鼠尿液中3種和肝組織中6種與急性肝損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物水平發(fā)生顯著改變，表明其造成小鼠肝損傷可能與機(jī)體能量和物質(zhì)代謝、氨基酸代謝及氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，黃獨(dú)素B主要是通過(guò)自由基氧化作用損傷肝細(xì)胞，其肝毒性的可能機(jī)制為其對(duì)機(jī)體三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、腸道菌群等產(chǎn)生影響。

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（收稿日期：2018-05-06 修回日期：2018-09-30）

（編輯：段思怡）