李慧勇 彭余江 何璽君 邵波 段虹宇 陳慧慧 楊帆 楊鵬翔 曾煜

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一種最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn)的非造血干細胞[1]。國際細胞治療協(xié)會（ISCT）在2006年發(fā)布了定義MSC的特性指南[2]，MSC具有多向分化能力，在適宜的條件下可以分化為神經(jīng)元。MSC因其自身特征成為目前基因工程的理想細胞。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve system，CNS）損傷修復是目前臨床函待解決的問題，傳統(tǒng)藥物包括氧自由基清除劑、能量代謝支持劑、神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑等神經(jīng)保護劑對神經(jīng)元再生療效并不確切。科學家在上世紀50年代首次發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）可直接促進神經(jīng)元損傷修復和再生[3]。NGF可經(jīng)細胞上受體信號通路介導，與效應細胞上跨膜糖蛋白結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號通路級聯(lián)反應，從而發(fā)揮促進神經(jīng)元發(fā)育、刺激神經(jīng)干細胞生長、調(diào)控細胞周期開關(guān)、影響海馬區(qū)神經(jīng)元增殖的生物學作用；其還可通過清除氧自由基及拮抗興奮性氨基酸神經(jīng)毒性修復損傷神經(jīng)元、阻斷神經(jīng)元凋亡[4-5]。本研究旨在探討NGF對MSC分化的影響，同時通過制備大鼠神經(jīng)細胞缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，觀察轉(zhuǎn)染NGF腺病毒的MSC移植對神經(jīng)元損傷的修復作用，以期為臨床上神經(jīng)元損傷的治療和并發(fā)癥的預防提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗用SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（合格證號：2007000571194），雌雄不限，體重250～300g，飼養(yǎng)于中科院上海生命科學院實驗動物中心SPF級動物實驗室，予標準飼料飼養(yǎng)并自由飲水。對照腺病毒AdGFP及目的腺病毒AdNGF購自于上海漢恒生物科技有限公司；1×PBS（中國 Sangon上海生工公司）；10cm細胞培養(yǎng)皿、10cm細胞培養(yǎng)瓶、Transwell細胞培養(yǎng)板（美國 Corning公司）；a-MEM（美國 HyClone公司）；IMDM（美國 HyClone公司）；0.25%Tripsin-EDTA （美國 HyClone公司）；FBS（美國 Hy-Clone公司）；青霉素/鏈霉素（美國 HyClone公司）；RIPA裂解液（中）：（中國碧云天公司,貨號：P0013C）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天公司,貨號：P0006）；BlkTMNoise Cancelling Reagents（德國 Millipore公司）；PVDF膜（德國Millipore公司），TUNEL試劑盒（中國南京路飛生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSC的分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死SD大鼠，75%乙醇浸泡后，取出股骨和脛骨，PBS洗凈，用大號注射器吸取MSC培養(yǎng)液（a-MEM+10%FBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素）沖出骨髓，適度吹散，加入MSC培養(yǎng)液10ml，吹打均勻，加入10cm的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%二氧化碳孵育箱培養(yǎng)，24h后進行第 1次換液，將未貼壁的細胞全部棄掉，以后隔日換液，在倒置顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)及生長情況。待細胞密度達到70%～80%時進行傳代培養(yǎng):（1）棄去培養(yǎng)液,加入0.25%的胰酶液 5ml，37℃消化 5min；（2）加入含 5%FBS 的IMDM細胞培養(yǎng)液 5ml終止消化；（3）將其移至15ml離心管中，2 000r/min，離心 3min；（4）棄去上清液，沉淀中加入含15%FBS的IMDM細胞培養(yǎng)液10ml，吹打均勻，按1∶3傳代進行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)過程中隔日換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底面，再重復以上操作。細胞長密后進行傳代，凍存早代數(shù)細胞，盡量用6代以內(nèi)的細胞進行實驗。

1.2.2 大鼠MSC轉(zhuǎn)染AdNGF腺病毒 將MSC細胞以3×105細胞/孔的密度鋪種至6孔板，分別加入對照腺病毒AdGFP、目的腺病毒AdNGF轉(zhuǎn)染。腺病毒感染2h后換正常細胞培養(yǎng)液，36h后進行后續(xù)實驗。提取MSC細胞總蛋白，Western blot法檢測NGF蛋白的表達。

1.2.3 大鼠原代神經(jīng)元分離培養(yǎng) 3d內(nèi)出生的新生鼠數(shù)只，剪斷頭，剪開頭皮與顱骨，暴露大腦兩半球，剝離軟腦膜及表面血管，夾取大腦皮層組織，放入冰上裝有解剖液的小燒杯，剪碎腦組織至1mm3大小，棄去原解剖液，加入新解剖液,移入15 ml離心管中，靜置；去上清液（解剖液，含血清，影響胰酶消化），加入4倍體積的0.25%胰酶，輕柔吹打數(shù)下，37℃消化5min；吸出上清液至裝有少量小牛血清的15ml離心管中，終止消化，共反復數(shù)次（不超過6次）至消化完全；匯集數(shù)次消化后上清液，過180目篩移入離心管，800r/min，7min后吸去上清液，用含3ml 10%FBS與5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞；細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×105種入鋪好多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿或96孔板中，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用含2%B27的神經(jīng)元培養(yǎng)基換液，培養(yǎng)48h，加入阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細胞，24h后換去含阿糖胞苷的培養(yǎng)基，每3d半換液1次。

1.2.4 大鼠神經(jīng)元OGD模型的制備與MSC培養(yǎng)上清液對神經(jīng)元損傷的影響 去除AdGFP、AdNGF轉(zhuǎn)染的MSC細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入無糖基本培養(yǎng)基培養(yǎng)6h，分別收集兩者的培養(yǎng)上清液；將大鼠原代神經(jīng)元移至預鋪多聚賴氨酸的玻片上或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，去除細胞培液，PBS洗1遍，加入OGD培養(yǎng)液[154 mmol/L NaCl、5.6mmol/L KCl、5.0 mmol/L HEPES、3.6mmol/L NaHCO3、2.3mmol/L CaCl2（pH 7.4）]，分為3組，按5%的比例分別加入AdGFP轉(zhuǎn)染的MSC細胞培養(yǎng)上清液（AdGFP-MSC組）、AdNGF轉(zhuǎn)染的MSC細胞培養(yǎng)上清液（AdNGF-MSC組）及無糖培養(yǎng)基（Control組）。將上述細胞培養(yǎng)皿密封放入無氧培養(yǎng)箱中，4h后取出細胞玻片，PFA固定，作TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡情況，confocol拍照。并收集上述細胞，采用Western blot法檢測保護性信號通路磷酸化Akt（p-Akt）表達水平。

1.3 觀察指標 （1）觀察大鼠MSC感染AdNGF腺病毒后NGF的過表達情況；（2）觀察大鼠原代神經(jīng)元分離培養(yǎng)結(jié)果；（3）比較 AdNGF-MSC組、AdGFP-MSC組、Control組大鼠原代神經(jīng)元凋亡情況及p-Akt表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSC感染AdNGF腺病毒后NGF的過表達情況 大鼠MSC分別感染對照腺病毒AdGFP與目的腺病毒AdNGF 36h后，兩者的腺病毒綠色熒光蛋白表達情況均良好，腺病毒感染效率較高（圖1）。Western blot實驗結(jié)果表明大鼠MSC感染AdNGF腺病毒后NGF的過表達效果好（圖2）。

2.2大鼠原代神經(jīng)元分離培養(yǎng)結(jié)果 大鼠原代分離的神經(jīng)元呈長梭形，生長狀態(tài)良好（圖3）。

圖1 大鼠MSC感染腺病毒36h后綠色熒光蛋白的表達情況（a：腺病毒 AdGFP；b：腺病毒 AdNGF；×200）

圖2 大鼠MSC感染腺病毒AdGFP與腺病毒AdNGF后NGF的表達電泳圖

圖3 原代分離的大鼠神經(jīng)元形態(tài)學表現(xiàn)（×200）

2.3 AdNGF-MSC 組、AdGFP-MSC 組、Control組大鼠原代神經(jīng)元凋亡情況比較 經(jīng)OGD處理的原代神經(jīng)元中，與Control組比較，AdGFP-MSC組凋亡細胞比例降低，而AdNGF-MSC組凋亡細胞比例大幅度降低，表現(xiàn)為綠色熒光點的數(shù)量及比例均有相應減少（圖4）。

圖4 大鼠原代神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL染色，×200）

2.4 AdNGF-MSC 組、AdGFP-MSC 組、Control組大鼠原代神經(jīng)元p-Akt表達水平比較 經(jīng)OGD處理的原代神經(jīng)元中，與Control組比較，AdGFP-MSC組p-Akt的表達上調(diào)，而AdNGF-MSC組p-Akt的表達更進一步上調(diào)（圖 5）。

圖5 AdNGF-MSC組、AdGFP-MSC組、Control組大鼠原代神經(jīng)元p-Akt表達水平比較

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復一直是研究熱點，尤其是針對CNS的損傷。CNS內(nèi)神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞之間通過軸突和樹突形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，精確掌控感覺、運動以及高級認知功能。神經(jīng)元缺少分裂、增殖的自我修復能力，損傷后由增生的膠質(zhì)細胞來代替，所以CNS常遺留嚴重的神經(jīng)功能缺失。藥物治療CNS損傷的生物活性物質(zhì)NGF能夠促進神經(jīng)元的存活和軸突的生長，并在體內(nèi)被證實能夠促進CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的再生[6]。NGF要局部、持續(xù)地安全高效遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的損傷部位，就需要借助藥物遞送系統(tǒng)，如采用乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)等方法制備出的包封神經(jīng)營養(yǎng)因子微球體作為藥物遞送系統(tǒng)，能在較長時間持續(xù)緩慢地釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，改善損傷的神經(jīng)組織微環(huán)境，促進神經(jīng)組織的修復[7]。有學者設計了包封NGF的膠原蛋白微球體使NGF得以長期緩慢釋放[8]。這些藥物遞送系統(tǒng)都因NGF具有高度的親水性，從而導致最初顯著的爆發(fā)式釋放[9]，不能滿足在體內(nèi)長期釋放的需求。將包封NGF的微球體固定到神經(jīng)支架中，可能會顯著地減少最初爆發(fā)式釋放的特征，NGF、微球體、神經(jīng)支架與靶細胞組合起來的復合材料將是應用到神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的研究方向和趨勢[10-11]。

MSC因其自身特征成為目前基因工程的理想靶細胞。MSC可在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)修復過程中減少軸突的神經(jīng)病理改變[12]。Lai等[13]分離了間充質(zhì)干細胞外泌體（MSC-exosomes），MSC-exosomes能夠增加神經(jīng)突分支數(shù)量和神經(jīng)突的總長度。此保護和促生長機制源于MSC-exosomes中的miR-133b[14]。MSC與缺血組織共培養(yǎng)后，MSC和MSC-exosomes中的miR-133b含量都明顯增多，其后MSC-exosomes將其中的miR-133b轉(zhuǎn)運至神經(jīng)組織以產(chǎn)生保護作用[15]。MSC-exosomes能夠模擬MSC的生物學功能，靶細胞可以膜融合或者內(nèi)吞作用獲取MSC-exosomes中的生物活性物質(zhì)。MSC-exosomes更穩(wěn)定，更好保存，易于管理和控制，可以人為的改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量[16-17]。

NGF可參與神經(jīng)細胞的生長、增殖、分化、存活及凋亡過程，在腦微環(huán)境中具有保護MSC不被破壞,促進其增殖分化、發(fā)揮其相應功能的作用[18]，但NGF促進MSC的分化的機制有待研究。NGF直接腦內(nèi)注射和微囊化后植入腦內(nèi)，可能損傷腦組織和引起機體的免疫排斥反應，采用NGF修飾的MSC作為載體，可解決藥物遞送系統(tǒng)中NGF遞送給藥釋放問題，使其在腦內(nèi)的生物活性持續(xù)時間較長，且可利用NGF能促進MSC向神經(jīng)元分化的功能，使MSC移植腦內(nèi)后最大限度地補償損傷和死亡的神經(jīng)細胞、重建神經(jīng)環(huán)路，從而達到恢復神經(jīng)功能的目的。

本研究結(jié)果表明，AdNFP腺病毒感染的MSC培養(yǎng)上清液可以大幅度降低原代神經(jīng)元凋亡細胞比例。用AdGFP腺病毒感染的MSC培養(yǎng)上清液可以上調(diào)原代神經(jīng)元保護性信號通路p-Akt的表達水平，而用AdNGF腺病毒感染的MSC培養(yǎng)上清液可以更進一步上調(diào)原代神經(jīng)元p-Akt的表達水平。這說明MSC的培養(yǎng)上清液可以一定程度上保護原代神經(jīng)元抵抗OGD損傷，而過表達NGF之后的MSC培養(yǎng)上清液可以進一步保護原代神經(jīng)元。NGF聯(lián)合MSC移植治療中樞神經(jīng)損傷或為臨床一種新思路。