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(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 博士后科研工作站，河南 項(xiàng)城 466200)

甜菜堿是甘氨酸的三甲基化衍生物，幾乎存在于所有的生物體中.自從1982年Galinski等[1]首次報(bào)道細(xì)菌Halorhodospirahalochloris利用甜菜堿之后，在許多微生物中相繼發(fā)現(xiàn)了甜菜堿的生物合成和利用.大多數(shù)嗜鹽細(xì)菌和耐鹽細(xì)菌，包括一些生活在高滲環(huán)境中的光合自養(yǎng)藍(lán)藻和硫細(xì)菌，可以合成甜菜堿并用作有效的滲透劑[2].大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和球形節(jié)桿菌等異養(yǎng)細(xì)菌也可以自身合成甜菜堿[3].大多數(shù)異養(yǎng)細(xì)菌不能合成甜菜堿，但可以吸收和利用環(huán)境中的甜菜堿對(duì)抗?jié)B透脅迫，例如在根瘤菌科Rhizobiaceae家族發(fā)現(xiàn)的代表性菌株[4].最近，在真菌類微生物中也發(fā)現(xiàn)了甜菜堿的生物合成途徑.在煙曲霉中，甜菜堿不參與應(yīng)激調(diào)節(jié)，僅在膽堿分解代謝中起著代謝中間體的作用，并可用作營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5].甜菜堿不僅對(duì)天然微生物群有功效，而且對(duì)工業(yè)微生物發(fā)酵也有顯著效果.甜菜堿的使用提高了工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中菌株的發(fā)酵性能，例如，甜菜堿的添加可以有效提高乳酸菌在脫水、貯存和復(fù)溶過(guò)程中的存活率[6].總之，微生物普遍將甜菜堿作為一種應(yīng)激保護(hù)劑或關(guān)鍵代謝中間體加以利用.在這篇綜述中，筆者總結(jié)了多種微生物中甜菜堿的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝的共同特征.此外，本綜述提供了甜菜堿在微生物發(fā)酵中的最新研究進(jìn)展，并討論了其在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景.

1 微生物中甜菜堿的生物合成途徑

與動(dòng)植物類似，大多數(shù)微生物通過(guò)利用兩種酶(膽堿脫氫酶和甜菜堿醛脫氫酶)兩步氧化膽堿合成甜菜堿(圖1).然而，在微生物中已經(jīng)鑒定出另一種生物合成途徑，即利用甘氨酸經(jīng)過(guò)三步甲基化合成甜菜堿(圖1)，在動(dòng)植物相關(guān)研究中尚未有該途徑的報(bào)道.

圖1 微生物中甜菜堿的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of betaine in microorganisms

1.1 膽堿氧化途徑

在大多數(shù)微生物細(xì)胞中甜菜堿通過(guò)膽堿兩步氧化法合成.不同微生物中，第一步氧化反應(yīng)涉及的酶(催化膽堿到甜菜醛)是具有多樣性的.在大腸桿菌中，膽堿脫氫酶催化膽堿的第一步氧化反應(yīng)，該酶與膜結(jié)合，需要FAD參與并使用氧作為電子受體[7].在枯草芽孢桿菌中，第一步氧化反應(yīng)則由不同的膽堿脫氫酶催化，該酶為NAD+依賴的III型醇脫氫酶，利用NAD+作為電子受體[3].在煙曲霉中，膽堿氧化酶催化第一氧化步驟，并使用氧作為電子受體[5].

相比之下，不同微生物中第二步氧化反應(yīng)涉及的酶是相對(duì)保守的.在細(xì)菌和真菌中廣泛存在可溶性的NAD+依賴的甜菜醛脫氫酶，該酶可以使用NAD+作為電子受體將甜菜醛氧化成甜菜堿[3,5,7].

1.2 甘氨酸甲基化途徑

一些微生物可以通過(guò)甘氨酸甲基化合成甜菜堿(圖1).體外14C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明：S-腺苷甲硫氨酸可以作為甲基供體用于甘氨酸到肌氨酸，肌氨酸到二甲基甘氨酸以及二甲基甘氨酸到甜菜堿的轉(zhuǎn)化過(guò)程[9].該途徑已經(jīng)在古細(xì)菌Methanohalophilusportucalensis、藍(lán)藻Aphanothecehalophytica、光致硫細(xì)菌Ectothiorhodospirahalochloris、嗜鹽放線菌Actinopolysporahalophile、嗜鹽光養(yǎng)菌H.halochloris和藍(lán)細(xì)菌Synechococcussp.WH8102中發(fā)現(xiàn).已經(jīng)從上述微生物中分離并鑒定出甘氨酸甲基化反應(yīng)涉及的三種酶，包括甘氨酸肌氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(GSMT)、肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SDMT)和二甲基甘氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(DMT)[10-12].

從甘氨酸合成甜菜堿是微生物中罕見的代謝途徑，因?yàn)榧谆磻?yīng)是自然界中最耗能的過(guò)程之一，如S-腺苷甲硫氨酸的一分子活性甲基的形成需要消耗細(xì)胞12分子的ATP[13].在微生物體內(nèi)存在如此耗能的途徑可能與以下原因有關(guān)：1) 一些甜菜堿依賴性的厭氧微生物不能進(jìn)行氧依賴性膽堿氧化，例如嗜鹽甲烷菌M.portucalensis無(wú)法在胞內(nèi)進(jìn)行膽堿的氧化；2) 一些甜菜堿依賴性的微生物不表達(dá)膽堿氧化酶基因，如光合細(xì)菌E.halochloris；3) 一些極端嗜鹽微生物同時(shí)含有膽堿氧化和甘氨酸甲基化途徑，例如嗜鹽放線菌在膽堿含量較低的環(huán)境中可以使用耗能的甲基化途徑緊急合成甜菜堿.

2 微生物中甜菜堿的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

甜菜堿及其前體膽堿是自然界中普遍存在的化合物.這些化合物被微生物利用于抵御環(huán)境脅迫[14].考慮到甜菜堿合成需要消耗能量，從環(huán)境中直接攝取甜菜堿是一種更為經(jīng)濟(jì)合理的方式.

細(xì)菌和古細(xì)菌演化出一整套運(yùn)輸甜菜堿等相容性溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以滿足不同環(huán)境下的生理需求.由于甜菜堿和其他相容性溶質(zhì)的主要功能為滲透保護(hù)，所以這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通常在高滲透壓下才會(huì)發(fā)揮作用.滲透壓的變化會(huì)引起相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化.其中，一些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能對(duì)特定的底物(包括甜菜堿等)表現(xiàn)出高親和力，而一些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)則展現(xiàn)出廣泛的底物特異性并允許細(xì)胞利用環(huán)境中存在的一系列相容性溶質(zhì)[15].表1中總結(jié)了兩類代表性的甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(也稱ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

表1 微生物中的甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Table 1 Betaine transporters in microorganisms

3 微生物中甜菜堿的分解代謝途徑

微生物中存在不同的甜菜堿分解代謝途徑，其中最為普遍的是通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移將甜菜堿轉(zhuǎn)化為甘氨酸(導(dǎo)致甲基基團(tuán)向甲硫氨酸循環(huán)供應(yīng)).此外，一些微生物如梭菌Clostridiumsporogenes和深海微生物可以將甜菜堿還原為乙酸根和三甲基胺(Stickland反應(yīng))[30].而有些微生物甚至可以利用甜菜堿作為唯一的碳源和氮源使用[31].

3.1 甜菜堿在甲基代謝中的作用

微生物中存在甲硫氨酸循環(huán)，該循環(huán)最終能夠?qū)⒓谆鶑募琢虬彼徂D(zhuǎn)移到甲基受體.如圖1所示，甲硫氨酸首先轉(zhuǎn)化為甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，然后再將甲基轉(zhuǎn)移至甲基受體.甲基轉(zhuǎn)移后，SAM降解為S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，隨后降解為高半胱氨酸(HC).HC則可以與甜菜堿反應(yīng)重新形成甲硫氨酸.該反應(yīng)以甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)作為催化劑，將甜菜堿中的甲基轉(zhuǎn)移到HC形成甲硫氨酸，甜菜堿脫甲基后形成二甲基甘氨酸.BHMT依賴的甜菜堿分解代謝在自然界中廣泛存在，在細(xì)胞甲基代謝中發(fā)揮重要作用.

BHMT作為甜菜堿分解代謝的關(guān)鍵酶已被廣泛研究，其中來(lái)源于哺乳動(dòng)物的BHMT為扭曲桶狀的鋅結(jié)合酶[32]，盡管在微生物中已經(jīng)證明存在BHMT，但是其編碼基因很少能夠被鑒定出來(lái)，這可能是由于哺乳動(dòng)物BHMT和微生物BHMT之間的相似度極低.只有一種來(lái)自中華根瘤菌的BHMT基因與來(lái)源于哺乳動(dòng)物BHMT基因具有較高的相似度[33],而其他微生物來(lái)源的BHMT基因，例如農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumafaciens和綠膿假單胞菌Pseudomonasaeruginosa，與哺乳動(dòng)物來(lái)源的BHMT基因相比沒(méi)有同源性[31].據(jù)報(bào)道，在脫硫桿菌中存在一種不同類型的甜菜堿甲基轉(zhuǎn)移酶(三甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶家族)，可以通過(guò)四氫葉酸(THF)中間體將甲基氧化成二氧化碳，同時(shí)將甜菜堿脫甲基化形成二甲基甘氨酸[34].此外，甜菜堿代謝與氨基酸代謝和中心代謝有關(guān).二甲基甘氨酸可以進(jìn)一步分解成肌氨酸和甘氨酸，甘氨酸可進(jìn)一步代謝產(chǎn)生丙酮酸產(chǎn)物[35].因此，某些需氧菌，如假單胞菌，可以通過(guò)甜菜堿來(lái)合成許多細(xì)胞組分[31].

3.2 其他分解代謝途徑

有些微生物演化出特殊的甜菜堿分解代謝途徑.例如，膽堿氧化為甜菜堿原本是不可逆的催化反應(yīng)，然而，對(duì)青霉Penicilliumfellutanu和構(gòu)巢曲霉Aspergillusnidulans的代謝研究表明甜菜堿可以轉(zhuǎn)化為甜菜堿醛并進(jìn)一步被還原成膽堿[36-37].這種從甜菜堿到膽堿的特殊還原途徑進(jìn)一步揭示出膽堿在真菌中的基本功能，但甜菜堿在該途徑中的生物化學(xué)和分子代謝過(guò)程仍有待闡明.

甜菜堿也可以被分解為其他功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).例如，通過(guò)Stickland反應(yīng)，甜菜堿可以在甜菜堿還原酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜猁}和三甲胺.三甲胺是某些微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如Methanosarcina屬的菌株.最近的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，協(xié)作性的原核生物群體能夠利用甜菜堿分解形成的功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適應(yīng)最惡劣的環(huán)境[30].

4 甜菜堿在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用

甜菜堿已經(jīng)成功應(yīng)用于應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域.甜菜堿主要用作應(yīng)激保護(hù)劑或細(xì)胞內(nèi)酶的穩(wěn)定劑以抵抗脅迫條件.同時(shí)，甜菜堿也被用來(lái)作為甲基化反應(yīng)的甲基供體.在大多數(shù)情況下，培養(yǎng)基中甜菜堿的補(bǔ)充不會(huì)顯著提高生產(chǎn)成本或改變發(fā)酵過(guò)程.甜菜堿可以從豐富的自然資源中獲得，價(jià)格約為1 200 美元/噸.考慮到其添加量低(約1～2 g/L)，單位成本相當(dāng)?shù)停瑹o(wú)需復(fù)雜的預(yù)處理就可以直接添加到培養(yǎng)基中.然而，甜菜堿目前僅應(yīng)用于少數(shù)的微生物反應(yīng)過(guò)程，如表2所示.隨著對(duì)微生物中甜菜堿功能和甜菜堿代謝的進(jìn)一步了解，預(yù)計(jì)其在微生物發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用將會(huì)擴(kuò)大.

表2 甜菜堿在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用Table 2 Application of betaine in microbial fermentation

4.1 細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

作為最普遍的滲透劑之一，甜菜堿可以提高微生物細(xì)胞的滲透耐受性，因?yàn)樗梢栽诩?xì)胞內(nèi)高濃度積累(通過(guò)運(yùn)輸或生物合成)，從而平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓力.甜菜堿可以增加脫水和補(bǔ)液期間微生物細(xì)胞的存活率，在早期應(yīng)用甜菜堿時(shí)，利用該性質(zhì)來(lái)保護(hù)儲(chǔ)藏和活化過(guò)程中的工業(yè)微生物菌株.另一個(gè)有效策略是在發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)充甜菜堿.如已報(bào)道的在乳酸鹽、乙醇、賴氨酸和丙酮酸鹽的發(fā)酵中添加甜菜堿，可以增加細(xì)胞生長(zhǎng)速率，并且可以改善高滲脅迫條件(高濃度碳水化合物底物或產(chǎn)物)下菌株的發(fā)酵性能(表2).

4.2 酶保護(hù)劑

甜菜堿不僅可以保護(hù)整個(gè)細(xì)胞，還可以保護(hù)各種細(xì)胞內(nèi)成分免受環(huán)境壓力，包括應(yīng)激敏感的蛋白質(zhì)和酶.例如，甜菜堿對(duì)天然蛋白質(zhì)提供熱保護(hù)，并有益于大腸桿菌細(xì)胞中應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集體的恢復(fù)[44].另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿可以克服脫水或滲透脅迫下蛋白質(zhì)擁擠的不穩(wěn)定作用[45].此外，微生物發(fā)酵中添加甜菜堿是有效的，因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程存在滲透脅迫，而代謝關(guān)鍵酶對(duì)滲透脅迫是敏感的.甜菜堿可以增加乳酸、賴氨酸和支鏈淀粉酶發(fā)酵中關(guān)鍵酶的活性，從而提高這些產(chǎn)品的產(chǎn)量(表2).此外，最新研究表明，甜菜堿及其類似物對(duì)各種酶如葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、乳糖脫氫酶、硫酸酯酶和辣根過(guò)氧化物酶都具有保護(hù)作用，這些酶在凍融之后大部分活性得到保留[46].

4.3 甲基供體

SAM依賴性和甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的甲基化反應(yīng)常常發(fā)生在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然化合物的生物合成中，因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中通常有一個(gè)或多個(gè)甲基.通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移來(lái)補(bǔ)充相應(yīng)的甲基供體可以提高這些天然化合物的產(chǎn)量.例如，補(bǔ)充甜菜堿可以顯著改善硝酸假單胞菌維生素B12的工業(yè)發(fā)酵[43]，因?yàn)榫S生素B12在其最終結(jié)構(gòu)中含有8個(gè)甲基.與銅綠假單胞菌類似[31]，生產(chǎn)維生素B12的脫氮硝酸菌也含有有效的甜菜堿分解代謝途徑，可以從甜菜堿中除去甲基，隨后將甲基用于甲硫氨酸，SAM和維生素B12的合成中.在維生素B12的生產(chǎn)中，甜菜堿不斷流加到培養(yǎng)基中用于分解代謝，其添加量約為甜菜堿用于細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)或酶保護(hù)劑時(shí)的10倍.這種添加量的差異進(jìn)一步證明甜菜堿在維生素B12生產(chǎn)中可作為甲基供體.然而，這種應(yīng)用在微生物中并不多見，因?yàn)橹挥泻苌俚奈⑸锞哂刑鸩藟A的天然分解代謝途徑.

5 結(jié) 論

甜菜堿由于具有優(yōu)良的生物相容性、合理的碳氮比和高豐富度而成為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、甲基供體以及微生物的直接營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).在這篇綜述中，總結(jié)了微生物中甜菜堿代謝的途徑、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和關(guān)鍵酶，為甜菜堿的研究提供了最新的概述.隨著甜菜堿分解代謝途徑的不斷剖析，其可以被設(shè)計(jì)到已知的微生物工程菌株中來(lái)增強(qiáng)甲基代謝，使微生物能夠更加高效的生產(chǎn)某些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物.甜菜堿獨(dú)特的生物相容性及生理活性將使其在生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.