張 蕾，郭曦堯，尹玉偉，茆安婷，代 靜，程 義，秦 悅，王云翔，李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118)

工業(yè)“三廢”、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生活污水的大量排放，使得水體重金屬含量居高不下。目前，水體污染的重金屬主要包括鉛、汞、鎘、鋅、銅等。鉛作為一種在自然界中普遍存在的重金屬，具有不易降解、強神經(jīng)毒性等特點，在微量條件接觸下便可對水生動物造成明顯的毒害作用[1]。在淡水系統(tǒng)中，魚樣品被認(rèn)為是評估衡量重金屬污染潛力的最具指示性的因素之一，而重金屬在魚類組織中的生物積累最終會對人類健康造成威脅[2]。因此，在環(huán)境污染的背景下，研究重金屬在魚類機(jī)體中的生物蓄積及代謝不容置疑。

如今，利用微生物吸附法凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，從而達(dá)到改善和恢復(fù)養(yǎng)殖水體的生態(tài)環(huán)境，被越來越多地應(yīng)用于生產(chǎn)[3]。研究顯示[4]，不少微生物材料在將重金屬濃度1 μg/mL降低到μg/mL的千分之一水平時具有很高的根除率。但是，對于微生物是否可以有效清除動物機(jī)體內(nèi)重金屬含量的報道還較少。不少報道還指出[5]，益生菌不僅可以有效吸附重金屬離子，而且在緩解氧化應(yīng)激與氧化損傷等方面有著顯著的表現(xiàn)。因此，本試驗嘗試將一株魚源性枯草芽孢桿菌添加至飼料中，通過檢測不同濃度鉛暴露鯽魚組織內(nèi)含鉛量及軀干腎抗氧化酶活力變化，評價該菌種對其各組織中鉛代謝的促進(jìn)及氧化損傷的緩解作用。從而為微生物飼料添加劑在重金屬中毒方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康鯽魚360尾，均質(zhì)量60±1.65 g，由長春市新立城水庫提供。

1.2 主要試劑及儀器 試劑：三水合醋酸鉛[(CH3COO)2Pb·3H2O]，購自天津永晟精細(xì)化工有限公司。配置鉛溶液母液：10 mg/L Pb2+、稱取18.3 g三水合醋酸鉛，充分溶解于1 000 mL雙蒸水，配置好后置于密封瓶中保存?zhèn)溆茫粷庀跛?HNO3)；濃高氯酸(HClO4)；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液；SOD、CAT、GSH及T-AOC試劑盒，均購自南京建成生物工程有限公司。儀器：日本島津AA-6880F/AAC型原子吸收分光光度計；Epoch2型微孔板分光光度計。

1.3 試驗設(shè)計 實驗鯽魚經(jīng)兩周馴化飼養(yǎng)后，選取健康、質(zhì)量相近的鯽魚隨機(jī)分為8個處理組，每個處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)15尾魚。實驗Ⅰ組為對照組；實驗Ⅱ組為益生菌對照組；Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ組分別控制水體鉛濃度為0.05 mg/L Pb、0.5 mg/L Pb、1 mg/L Pb；益生菌治療組(Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ組)分別為0.05 mg/L Pb+WB600、0.5 mg/L Pb+WB600、1 mg/L Pb+WB600，實驗為期60 d。

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗開始后每天8點和18點兩次投喂，按魚體重3%日投喂量飼喂。飼養(yǎng)水為充分曝氣的自來水，每缸水為80 L，每2天換一次，換水量為總量的1/3，水溫維持在24 ℃±2 ℃，水的pH值為7.2～7.4，水中溶解氧為7.2～7.6 mg/L，保持供養(yǎng)泵24 h開啟，實驗周期為60 d。

1.5 菌株活化及飼料制作 WB600為一株魚源性枯草芽孢桿菌，并保藏于-80 ℃冰箱中。參照《微生物學(xué)實驗技術(shù)》的方法并稍作修改，將該菌種接入LB液體培養(yǎng)基(pH值 7.2～7.4)中進(jìn)行活化，按照2%接種量進(jìn)行擴(kuò)增，37 ℃條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期，6 000 r/min(4 ℃)離心10 min，棄上清液得到菌泥，使用PBS洗滌，重復(fù)3次后重懸于無菌生理鹽水中(生理鹽水∶原菌液=1∶100)，將濃縮菌液用壓力噴嘴均勻噴入顆粒飼料中，現(xiàn)做現(xiàn)用。經(jīng)過多次試驗確定菌液與飼料的添加比例為100 mL∶800 g，使飼料中活菌含量保持為109CFU/g。

1.6 樣品處理 組織采集冰盤上剖檢，取腦、鰓、肝胰臟、軀干腎、腸及肌肉，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗凈并用吸水紙吸干后置于無菌EP管中-80 ℃保存待用。

1.7 腦、鰓、肝胰臟、軀干腎、腸、肌肉中鉛濃度的測定 檢測前，準(zhǔn)確稱取樣品，將樣品置于三角錐瓶中后放入數(shù)粒玻璃球，加入10 mL混合酸(HNO3∶HClO4=4∶1)并加蓋浸泡過夜。使用微波消解爐消解后消化液成無色透明或略帶黃色，待消化液冷卻，將其轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用去離子水少量多次洗滌三角錐瓶后洗液合并于容量瓶中定容，使用原子吸收光譜分析儀測定其鉛含量。用同一方法做試劑空白試驗。

1.8 軀干腎中抗氧化酶活力的測定 準(zhǔn)確稱取組織重量后按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織并在冰水浴條件下制備勻漿，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清待用。CAT、SOD、GSH及T-AOC測試的具體操作按南京建成生物工程公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SEM )表示，采用IBM SPSS Statistics 20軟件Tukey單因素分析法統(tǒng)計分析。試樣中鉛在魚體組織的含量按以下公式計算：

注：X：樣品鉛含量； C1：測定樣品鉛含量； C0：試劑空白液鉛含量； V：樣品處理后總體積； m：樣品質(zhì)量

2 結(jié)果

2.1 臟器鉛濃度變化 如表1所示，與Ⅰ組相比，鯽魚各組織中鉛含量均顯著升高(P<0.05)，且與水體鉛濃度呈正相關(guān)。鉛在鯽魚的富集量取決于組織的不同，各組織鉛積蓄量由高到低依次為：鰓>軀干腎>腸>肝胰臟>腦>肌肉。在0.05 mg/L鉛暴露下，相比于Ⅳ組，Ⅲ組鯽魚鰓、肝胰臟、軀干腎、腸及肌肉鉛含量均顯著降低(P<0.05)，腦中鉛含量降低，無顯著差異(P>0.05)。在0.5 mg/L鉛暴露下，相比于Ⅵ組，Ⅴ組鯽魚腦、軀干腎、腸及肝胰臟中鉛含量顯著降低(P<0.05)，肌肉中鉛含量略微降低，無顯著差異(P>0.05)；Ⅴ組鰓中鉛含量低于Ⅵ組，但無顯著差異(P>0.05)。在1 mg/L鉛暴露下，相比于Ⅷ組，Ⅶ組鯽魚腦、軀干腎、腸及肝胰臟中鉛含量顯著降低(P<0.05)，肌肉中鉛含量降低，但無顯著差異(P>0.05)；Ⅶ組與于Ⅷ組鯽魚鰓中鉛含量，無顯著差異(P>0.05)

2.2 軀干腎抗氧化酶活性變化 如圖1～4所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組鯽魚軀干腎CAT、SOD、GSH及T-AOC水平均顯著提高(P<0.05)；在0.05 mg/LPb、0.5 mg/LPb及1 mg/L Pb濃度下，益生菌治療組鯽魚軀干腎CAT、SOD及GSH水平均顯著高于鉛暴露組(P<0.05)；相比于鉛暴露組，在0.05 mg/L Pb及1 mg/L Pb濃度下益生菌治療組鯽魚軀干腎T-AOC水平顯著提高(P<0.05)，在0.5 mg/L Pb濃度下無顯著差異(P>0.05)。

表1 鯽魚各組織鉛濃度 (ng/g)

注：標(biāo)有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)

圖1 軀干腎CAT活性變化

圖2 軀干腎SOD活性化

圖3 軀干腎GSH含量變化

圖4 軀干腎T-AOC活性變化

注：標(biāo)有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)

3 討論

3.1 不同濃度鉛暴露下鯽魚各組織鉛含量變化 鉛可通過表皮、腮溶解或經(jīng)過消化道進(jìn)入魚體。這種重金屬容易蓄積在魚體各組織，如腮、肝胰臟、腎臟等部位，并通過血腦屏障，從而對魚類的健康造成各種不利影響[6]。Meyer等[7]將小龍蝦暴露于20 mL/L鉛溶液和2 mL/L鎘溶液中處理10周后發(fā)現(xiàn)，鉛、鎘離子在消化腺及腮中累積量很高，而后腸和肌肉組織表現(xiàn)出很低的水平。Wu等[8]研究了白蝦在不同濃度鉛暴露下各器官鉛積累效應(yīng)，結(jié)果顯示，所有研究的組織中，最低的鉛積累在肌肉組織中。其他相關(guān)報道也顯示[9-10]，鰓、軀干腎、腸道及肝胰臟等器官是魚類機(jī)體重金屬蓄積的主要器官，肌肉并不是主要的重金屬堆積組織。本試驗中，我們可以觀察到鯽魚各組織鉛含量與水體鉛濃度呈正相關(guān)關(guān)系。其中，鯽魚腮、軀干腎、腸及肝胰臟的鉛含量顯著高于腦和肌肉，這與以往的研究結(jié)論相似。腮絲含有極高濃度的鉛，可能是由于長期直接接觸含有鉛離子的水體所導(dǎo)致；而腦中所含鉛量較低表明，血腦屏障雖有一定的保護(hù)作用，但隨著時間及鉛濃度的提高，大量鉛離子依舊能進(jìn)入腦組織中。Ewa等[11]通過飼喂普魯士鯉魚含鉛飼料后發(fā)現(xiàn)，鉛在不同組織中的生物蓄積濃度由高到低為：腎>肝>鱗>鰓>腸>肌肉>皮膚。這也表明，鉛通過不同途徑進(jìn)入動物機(jī)體，其各組織鉛蓄積量也會不同。

3.2 枯草芽孢桿菌對鯽魚各組織的鉛代謝作用 相關(guān)研究顯示[12-13]，一些益生菌在體外對重金屬離子有很好的結(jié)合能力。Zhai[14]等的試驗已證明乳酸桿菌菌株對小鼠中的鎘和鉛毒性具有保護(hù)作用，通過口服乳酸菌有效的減少了小鼠腸道鎘及鉛的吸收，并減少了其他組織中鎘和鉛的積累。在本試驗中我們也可以看到，0.05 mg/L的鉛暴露下，益生菌治療組鯽魚腦、鰓、肝胰臟、軀干腎、腸及肌肉內(nèi)鉛蓄積量均低于鉛暴露組。而0.5 mg/L及1 mg/L的鉛暴露下，益生菌治療組鯽魚腦、肝胰臟、軀干腎及腸鉛蓄積量均顯著低于鉛暴露組(P<0.05)，但鰓及肌肉中鉛蓄積量無顯著差異(P>0.05)；這是由于WB600僅通過口服方式進(jìn)入鯽魚機(jī)體，水體中WB600的菌落數(shù)較少不足作為有效的重金屬吸附劑來清除水體中的鉛離子，因而導(dǎo)致在稍高濃度的鉛暴露下，益生菌治療組鯽魚鰓中鉛含量與鉛暴露組無顯著差異(P>0.05)。WB600可能通過靜電力或絡(luò)合反應(yīng)吸附了腸道中大量的鉛離子，并加速腸道代謝，從而減少了鯽魚腸道中的鉛蓄積量。而WB600在鯽魚機(jī)體內(nèi)或產(chǎn)生大量的次生代謝物，并隨血液流經(jīng)鯽魚各部位，該產(chǎn)物可能是導(dǎo)致腦、肝胰臟及腎臟鉛含量降低的主要原因。

3.3 枯草芽孢桿菌對鯽魚軀干腎抗氧化酶活力的影響 大量鉛離子的進(jìn)入導(dǎo)致了機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，而益生菌可促進(jìn)或降低酶類抗氧化物的活性從而盡可能保證動物機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡[15]。Bhakta等[16]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，益生菌具有降低由重金屬毒性引起的氧化應(yīng)激；Balakrishnan等[17]以大鼠為試驗對象，對其皮下注射重鉻酸鉀后給予口服干酪乳桿菌，結(jié)果顯示，該菌株可保護(hù)腎臟等代謝器官免受來自重鉻酸鉀誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。本試驗中，在3種不同濃度鉛溶液暴露下，鯽魚在口服WB600后其腎臟抗氧化酶活性均得到提高。這表明，該菌株對于鉛毒性起到了一定緩解作用。

如此看來，飼喂枯草芽孢桿菌能有效降低鯽魚機(jī)體各組織中的鉛積蓄量，提高機(jī)體抗氧化能力，減少鉛暴露造成的氧化損傷。該試驗結(jié)果可為枯草芽孢桿菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)，而其具有的易獲得、可大規(guī)模生產(chǎn)、安全性高、益生強等特點更值得推廣使用。